Гидролиз рацемических амидов ферментами почвенных актинобактерий

• Автор: Горбунова, Анна Николаевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Пермь
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Амидазы - нитрилгидролизующие ферменты
1.1.1. Применение Б- и Б-энантиомеров аминокислот
1.1.2. Ь-селективные аминокислотные амидазы
1.1.3. Б-селективные аминокислотные амидазы
1.2. Биотрансформация субстратов иммобилизованными амидазами
1.2.1. Иммобилизация клеток с амидазной активностью
1.2.2. Иммобилизация выделенных амидаз
1.3. Факторы, влияющие на стереоселективность ферментов
1.4. Энантиоселективная биотрансформация Б,Ь-фенилглицинонитрила.
1.5. Биотрансформация фенилаланинамида
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Выделение и идентификация амидгидролизующих бактерий
2.3. Среды и субстраты для культивирования
2.4. Определение амидазной активности и стереоселективности штаммов
2.5. Выделение амидазы
2.6. Иммобилизация
2.7. Определение продуктов реакции трансформации нитрилов и амидов
2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция
2.9. Секвенирование ДНК
2. 10. Статистическая обработка
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ 11 гИосЬскгош 4-1 и
АпИгоЬаМег эр
3.1. Выделение и селекция штаммов, способных к стереоселективной трансформации Б,Ь-лактамида

3.2. ПЦР-анализ генов В-аминокислотных амидаз
3.3. Идентификация выделенных культур
3.4. Влияние источника углерода на рост и амидазную активность бактерий
3.5. Влияние источника азота на рост и амидазную активность бактерий .
3.6. Влияние иммобилизации на стереоселективные свойства внутриклеточных амидаз
ГЛАВА 4. СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ АМИДАЗ Я. гЬос/оскгоия 4-1 и Аг(кгоЬас1ег эр
4.1. Каталитические свойства амидазы, иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным бензохиноном
4.2. Стереоселективные свойства амидаз, иммобилизованных различными методами
4.3. Влияние температуры на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз
4.4. Влияние pH на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз
ГЛАВА 5. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИДОВ
АМИНОКИСЛОТ
5.1. Биотрансформация В,Е-фенилглицинонитрила
5.1.1. Скрининг микроорганизмов, способных к гидролизу В,Б-фенилглицинонитрила
5.1.2. Индукция нитрилгидролизующей активности штамма ЯкоАососст гкоЛосИгош
5.1.3. Трансформация Б,Е-фенилглицинонитрила изолированной амидазой Я. гкос1осИгот
5.1.4. Влияние температуры на активность и стереоселективность амидазы Я. НюАосИгоиз 4-1 в реакции гидролиза Б,Ь-
фенилглицинонитрила

5.1.5. Влияние иммобилизации нитрилгидратазы и амидазы
Я. гкос1осИгош 4-1 на стереоселективность реакции
5.2. Биотрансформация Ь-фенилаланинамида
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

модифицировать конформацию фермента, тем самым изменяя способ процесса молекулярного распознавания субстрата ферментом (Wu et al., 1991). Третья теория предполагает зависимость селективности от энергетики растворения субстрата (Ке et al., 1996; Wescott et al., 1996).
Температура и pH
Температура и pH оказывают значительное влияние не только на активность фермента, но и на его энантиоселективность.
Wang с соавт. показали, что путем изменения pH среды можно добиться повышения энантиомерной чистоты получаемого продукта. Изменение pH буфера с 7.62 до 7.13 привело к повышению энаитиоселективности нитрилазы, которая катализировала гидролиз D,L-фенилглицинонитрила (Wang et al., 2001).
В другой работе авторы продемонстрировали влияние температуры на энантиоселективность. Понижение температуры реакции с 30° до 20°С приводило к увеличению энантиоселективных свойств фермента Rhodococcus sp. AJ270, катализировавшего синтез оптически активной 2,2-диметилциклопропановой кислоты (Wang et al., 2002).
Стереоспецифичиость амидазы D. tsuruhatensis ZJB-05174 оказалась полностью зависимой от температуры. С повышением температуры реакции с 30° до 46°С наблюдали снижение энаитиоселективности фермента в 5 раз. Когда температура достигла 56°С, фермент потерял стереоспецифичность (Zheng et al., 2012). Это явление можно объяснить влиянием температуры на свободную энергию активации энантиомеров, которая подразделяется на энтальпический и энтропический компоненты (Prepechalova et al., 2001).
Влияние иммобилизации
Данных о влиянии иммобилизации на стереоселективные свойства ферментов имеется немного. В результате иммобилизации селективность может повышаться, снижаться или оставаться неизменной. Очевидно, что каждый специфичный фермент будет вести себя по-разному, каждый способ иммобилизации будет давать различный эффект.