Разработка и применение методов оценки качества дарбэпоэтина альфа в процессе биотехнологического производства

• Автор: Орлова, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние степени гликозилирования на биологическую активность белка

1.2. Особенности структуры, физических и биологических свойств эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина

1.3. Дженерики и проблемы воспроизведенных лекарственных препаратов

1.4. Краткая схема технологического процесса

1.5. Методы оценки качетва дарбэпоэтина альфа

1.6. Валидация аналитических методик в процессе биотехнологического производства лекарственных средств
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2Л. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Разработка методики оценки концентрации дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса производства
2.2.2. Валидация разработанных хроматографических методик количественного определения дарбэпоэтина
2.2.3. Разработка методики оценки степени гликозилирования дарбэпоэтина
2.2.4. Валидация методики установления подлинности дарбэпоэтина с помощью изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом
2.2.5. Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса
2.2.6. Стандартизация конечного продукта

2.2.7. Создание стандартного образца предприятия дарбэпоэтина
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ
РЕЗУЛЬТАТОВ
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ
ВЫВОДОВ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЭПО - эритропоэтин
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ОФ ВЭЖХ - обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
КЗЭ - капиллярный зональный электрофорез
ГЛФ - готовая лекарственная форма
RSD - относительное стандартное отклонение
ПААГ - полиакриламидный гель
ИФА - иммуно-ферментный анализ
ПКО - предел количественного определения
BRP - Biological Reference Preparation (биологический стандартный препарат)

использовались 12% разделяющий гель и 5% концентрирующий гель. Перед нанесением образцов на гель проводилась их пробоподготовка, путем разведения в 2 раза буфером для разведения образцов (0,05М трис-гидрохлорида, содержащего 2% додецилсульфата натрия, 0,1М дитиотреитола, 0,1% бромфенолового синего, 10% глицирина, рН=6,8), после чего образцы были прогреты при 100°С в течении 5 минут в термостате Eppendorf, Германия. На гель образцы наносились в объеме - 10 мкл.
Разделение проходило под напряжением 200 В в течение 50 мин в электрофорезной камере Bio-Rad, США. Гели окрашивались раствором серебра по следующей схеме: инкубация гелей в растворе уксусной кислоты и 40% этиловом спирте, затем инкубация в 10 % этиловом спирте, после гели промывались водой, далее инкубация в серебряно-нитратном реактиве, после чего опять проводилась промывка гелей водой. Проявление полос проходило в растворе 0,01% лимонной кислоты и 0,05% формальдегида, реакцию окрашивания останавливали раствором 10% уксусной кислоты.
Изоэлсктрическое фокусирование. Все пробы перед анализом предварительно были обессолены и сконцентрированы до 0,03 мг/мл, после чего они были переведены в 7,ЗМ раствор мочевины. Готовые образцы были нанесены в объеме 10 мкл на гель.
Изоэлектрическое фокусирование осуществляли в геле с градиентом pH от 2 до 10 с помощью системы GE Healthcare (Multiphor И, MultiTemp IV, EPS 3501 XL), США. В ходе анализа использовались следующие режимы: предфокусировка при напряжении 100 В, силе тока 24 мА и мощности 20 Вт в зечение 45 минут; вхождение белков в гель при напряжении 500 В, силе тока 24 мА и мощности 20 Вт в течение 30 минут и разделение при напряжении 1500 В, силе тока 24 мА и мощности 20 Вг в течение 60 минут. Для заливки геля использовали амфолиты Pharmalyte 3-10 (GE Healthcare, США) и Servalyt 2-4 (Serva, Германия). После проведения разделения белков гель отделяют от подложки после его инкубирования в растворе, содержащем 1% Tween-20, 0,05М трис(гидроксиметил)аминометана, 0,04М глицина, 0,4% додецилсульфата натрия,