Разработка эукариотического продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина и технологии его культивирования для целей биотехнологического производства

• Автор: Нурбаков, Альфред Анасович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Современные подходы к оптимизации технологии производства генно-инженерных продуктов

1.2. Получение клеточных линий - продуцентов рекомбинантных белков

1.3. Типы культивирования

1.4. Оптимизация физико-химических параметров культивирования.

1.5. Оптимизация состава питательной среды

1.6. Режимы культивирования

1.7. Оборудование для культивирования
1.8. Свойства дарбэпоэтина и его применение в медицине
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Создание эукариотического продуцента дарбэпоэтина
2.2.2. Оптимизация культивирования продуцента дарбэпоэтина
2.2.3. Процесс масштабирования в биореакторе
2.2.4. Процесс выделения и очистки дарбэпоэтина
2.2.5. Получение ГЛФ дарбэпоэтина
2.2.6. Оценка стабильности и эффективности процесса
2.2.7. Технологическая схема процесса суспензионного культивирования СНО
2.2.8. Экономическая эффективность производства дЭПО
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЕР - фактор элонгации
СНО - клетки яичников китайского хомячка
СМУ - цитомегаловирус человека
ОО - растворённый кислород
Б/МАЯ - промоторный элемент
805 - додецилсульфат натрия
АК - аминокислота
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГЛФ - готовая лекарственная форма
ДМСО - диметилсульфоксид
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
дЭПО - дарбэпоэтин
ИФА - иммуноферментный анализ
КЖ - культуральная жидкость
мАТ - моноклональное антитело
МЕ - международная единица
ПААГ - полиакриламидный гель
ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат
ХПН - хроническая почечная недостаточность
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭПО - эритропоэтин

поддерживать в процессе культивирования. Так, типичная скорость потребления глюкозы составляет 2-4 г/л/день, т.е. для ее поддержания на уровне 1-2 г/л необходимо контролировать остаточную концентрацию каждые 2-4 часа, в том числе ночью. В условиях производства это обычно неприемлемо, за исключением случаев, когда биореактор оборудован автоматической системой мониторинга в реальном времени.
В ходе процесса с добавлением подпитки культуральная жидкость не удаляется из сосуда. Тем не менее бывают режимы, которые характеризуются частичным удалением культуральной жидкости вместе с находящимся в ней требуемым белком определёнными порциями либо непрерывным потоком. Клетки-продуценты в ходе культивирования или остаются внутри сосуда, либо выводятся наружу вместе с культуральной жидкостью (44, 45). Первый режим называется перфузией, второй - режимом непрерывного культивирования. В режиме перфузии концентрация клеток в культуре способна достичь уровня 100 млн/мл, так как постоянный приток свежей среды поддерживает концентрацию нутриентов на постоянном, достаточно высоком уровне. Также увеличивается и объём продуцируемого линией требуемого белка. Тем не менее увеличенное потребление среды культивирования в большинстве случаев является фактором, сдерживающим применение перфузионного режима. Кроме того, для внедрения перфузии требуется дорогостоящее переоборудование имеющихся производств. Поэтому в данный момент культивирование производится, как правило, в режиме с добавлением подпиток, хотя доля перфузионных производств постоянно растет.
Оптимизация процесса культивирования осуществляется с помощью определения состава подпиток и графика их внесения в среду культивирования (127).
1.7. Оборудование для культивирования
Существенным этапом создания методики культивирования считается