Разработка подходов к повышению эффективности иммунологической диагностики туберкулеза легких

• Автор: Васильева, Елена Викторовна
• Шифр специальности: 14.03.09, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Актуальность темы исследования
Степень разработанности темы исследования
Цели и задачи
Научная новизна
Теоретическая и практическая значимость исследования
Методология и методы исследования
Положения, выносимые на защиту
Степень достоверности и апробация результатов
Глава 1 Эффективность применения метода QuantiFERON@-TB Gold in-tube в
диагностике туберкулеза легких
Глава 2 Установление информативных биомаркеров на основании изучения спонтанной и антиген-индуцированной продукции EGF, MIP-1 (3, VEGF, 1L-2,
1L-4, IL-6, IL-1 a, IFN-a2, TGFa, TNFa, s!L-2Ra, sCD40L, IP-
2.1 Поиск альтернативных биомаркеров для выявления туберкулезного инфицирования
2.2 Поиск биомаркеров, позволяющих проводить дифференциальную диагностику активного ТБ легких и ЛТБИ
2.3 Диагностические возможности комбинированного применения биомаркеров активности туберкулезного процесса
Глава 3 Разработка иммуноферментной тест-системы на основе
различных антигенов Mtb
3.1 Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа для выявления IgG антител к антигенам Mtb
3.2 Изучение диагностических параметров иммуносорбентов на основе антигенов CBD-CFP10, CBD-ESAT6, ESAT6-CFP10, CBD-P38 и PPDN3
3.3 Диагностические параметры иммуноферментной тест-системы при комбинированном использовании антигенов Mtb
Глава 4 Сравнительная ценность QuantiFERON®-TB Gold in-tube, неогперина и специфических противотуберкулезных антител для диагностики туберкулеза
легких
Глава 5 Разработка алгоритма иммунодиагностики туберкулеза легких
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Перспективы дальнейшей разработки темы
Список сокращений и условных обозначений
Список литературы
Приложения

Введение
Актуальность темы исследования
Туберкулез (ТБ) относят к числу социально-значимых инфекционных заболеваний. Несмотря на то, что согласно данным ФГУ «ЦНИИОИЗ Минздравсоц-развития РФ» заболеваемость ТБ на 100 ООО населения в 2012 г. снизилась до 68,1 с 73,0 в 2011 г., растет распространенность туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя, в т.ч среди ВИЧ-инфицированных.
Точная и быстрая диагностика играет ключевую роль в контроле над заболеванием (Al-Zamel F. Detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis // Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2009. Vol.7, N 9. P. 1099-1108). В настоящее время в лабораторной диагностике ТБ применяют микробиологические и молекулярногенетические методы исследования. Однако каждый из них имеет свои ограничения, связанные с трудоёмкостью, длительностью, а также с невозможностью выявления Mycobacterium tuberculosis (Mtb) в мокроте, в частности, при латентной туберкулезной инфекции (ЛТБИ). В этих случаях большое значение приобретают иммунологические методы исследования. На протяжении десятилетий с этой целью применяли кожно-аллергические пробы Манту и Пирке. Однако, с момента введения в нашей стране массовой вакцинации новорожденных авирулентным штаммом Mycobacterium bovis (М. bovis) BCG в 1949 г., диагностическое значение пробы с туберкулином снизилось из-за перекрестной сенсибилизации организма вакцинным штаммом М. bovis BCG и вирулентными штаммами Mtb при инфицировании (Митинская JT.A. Новые технологии при профилактике, выявлении, диагностике и лечении туберкулеза у детей // Проблемы туберкулеза. 2003. №1. С. 19-25), а также по той причине, что в качестве антигена используют PPD (purified protein derivate) - смесь более 200 антигенов, получаемых из микобактерий-возбудителей туберкулеза человека и крупного рогатого скота (Литвинов В.И. Латентная туберкулезная инфекция - миф или реальность? // Туберкулез и болезни легких. 2011. № 6. С. 3-9). В современных условиях доля ложноположительных реакций Манту составляет от 40 % до 90% (Белушков В.В. Значение диаскинтеста и

- 0,05 М цигратный буфер (ЦБП), рН=4,0. Состав: лимонная кислота одноводная (С6Н807-ІІ20); гидроксид натрия 1 М; гидроперит (комплекс перекись водорода -мочевина); 2-хлорацетамид (C2H4C1NO); вода дистиллированная.
- 0,006 М раствор тетраметилбензидина (ТМБ). Состав: диметилсульфоксид; 3,3',5,5'- тетраметилбензидин (C16H20N2) 98,0%; вода дистиллированная.
• коныогат: моноклональные антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена (ООО Биотехнологическая компания Капель)
• раствор для исследуемых проб (РИП) с добавлением лизата E. coli
Состав: ФСРТ, 0,3% пептон основной щелочной; краситель бром феноловый синий, азид натрия (NaN3) 1 г/л.
• карбопат-бикарбонатный буферный раствор (КБК), используемый для сорбции АГ на планшет, 0,05М, рН=9,5-9,6. Состав: 0,05М карбонат натрия (Na2C03); 0,05М гидрокарбонат натрия (NaHC03).
Для приготовления специфического иммуносорбента планшеты сенсибилизировали отдельными рекомбинантными белками в оптимальных концентрациях. Сорбцию проводили из сантимолярного карбонатно-бикарбонатного буфера (КБК) pH 9,5 в течение 16-20 часов при температуре 4-8°С. После сорбции раствор вытряхивали, лунки промывали дистиллированной водой и помещали в вакуумную бочку на 8 часов. Далее планшеты запаивали в герметичные полиэтиленовые пакеты и хранили при температуре 2 -4 °С. Непосредственно перед проведением анализа во все лунки вносили по 250 мкл ФСРТ на 1-2 мин, затем раствор удаляли насосом.
Методика проведения ИФА
Процедуру ИФА проводили по инструкции, прилагаемой к тест-системе иммуноферментной для обнаружения IgG к Mtb (ИФА-анти-ТУБ), выпускаемой Отделом Новых Технологий ФБУН НИИЭМ имени Пастера со следующими модификациями.
Одну из лунок (А1) заполняли ФСРТ - 100 мкл (контроль субстрата). В лунку А2 вносили 100 мкл раствора отрицательного контроля (НК - пул сывороток здоровых доноров, не содержащий IgG-антител к Mtb), в следующую лупку