Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива

• Автор: Фатыхова, Алина Ринатовна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Глицсрин-содержащие отходы производства биодизельного топлива и их

возможное применение в микробиологическом синтезе

1.1.1. Глицерин как субстрат для получения микробных метаболитов

1.1.2. Основные пути окисления глицерина

1.2. Микробиологическое получение лимонной кислоты

1.2.1. Лимонная кислота и ее соли, свойства и применение

1.2.2. Продуценты лимонной кислоты
1.2.3. Условия биосинтеза лимонной кислоты
1.2.4. Механизмы биосинтеза лимонной кислоты
1.2.4.1. Механизм биосинтеза лимонной кислоты грибами Aspergillus niger
1.2.4.2. Механизм биосинтеза лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Методика культивирования дрожжей
2.2.1. Подготовка посевного материала
2.2.2. Состав и подготовка основной среды
2.2.3. Методы культивирования дрожжей
2.3. Аналитические методы
2.4. Методы расчета технологических параметров ферментации
2.5. Определение активности ферментов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Способность дрожжей различного таксономического положения 63 синтезировать лимонную кислоту из глицерина, отбор продуцента
3.2. Основные условия и динамика образования лимонной кислоты дрожжами 68 Y. lipolytica
3.2.1. Влияние природы лимитирующего компонента на сверхсинтез лимонной
кислоты

3.2.2. Влияния различных факторов на образование лимонной кислоты дрожжами
У. Иро1уИса в среде с глицерином
3.3. Синтез лимонной кислоты дрожжами У. Иро1уИса в среде с глицерином
3.4. Синтез лимонной кислоты дрожжами У. Нро1уИса в среде с глицерин- 84 содержащими отходами производства биодизельного топлива
3.5. Анализ активности ферментов при биосинтезе лимонной кислоты из 94 глицерин-содержащих отходов дрожжами У. Нро1уйса
3.6. Разработка способа культивирования, обеспечивающего наиболее
продолжительный, интенсивный и стабильный синтез лимонной кислоты
3.6.1. Использование мембранного модуля для биосинтеза лимонной кислоты
3.6.2. Отъемно-доливной метод культивирования
ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ № 1
ПРИЛОЖЕНИЕ № 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ИЛК - трео-05-изолимонная кислота
КГК — кетоглутаровая кислота
ЛК - лимонная кислота
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
Р - продуктивность биомассы, г ЛЬС/г клеток
Удк - выход ЛК от потребленного субстрата, %
Yx/s — выход биомассы, %
р — удельная скорость роста, ч'
Ртах - максимальная удельная скорость роста, ч
qлк — удельная скорость синтеза, г Л К/ г биомассы- ч
Слк — объемная продуктивность процесса биосинтеза ЛК, г/л- ч
цлк - энергетический выход, %

При высокой концентрации этанола в культуральной жидкости замедляется рост клеток и биосинтез ЛК, поскольку количество образующегося в клетках ацетальдегида зависит от концентрации этанола - субстрата алкогольдегидрогеназной реакции. Ввиду токсичности этанола для клеток, а также меньшей устойчивости к этанолу мутантов Y. lipolytica по сравнению с природным штаммом, этанол нельзя добавлять в среду культивирования в больших количествах, необходима постоянная подпитка этанолом культуры в ходе культивирования. В работе Камзоловой с соавт. (1996) при хемостатном культивировании мутанта Y. lipolytica показано, что концентрация этанола в среде выше 2,64 г/л вызывала снижение скорости роста. Определенная графическим методом константа ингибирования для этанола составляет 11 г/л.
Следует отметить, что при росте на этаноле для дрожжей Y. lipolytica была обнаружена следующая закономерность: способность дрожжей синтезировать лимонные кислоты проявляется либо в условиях интенсивной аэрации среды (при низком обеспечении клеток железом), либо в условиях низкого содержания кислорода при достаточно высоком обеспечении клеток железом (Kamzolova et al., 2003).
Растительные масла. При росте дрожжей на растительных маслах образование лимонных кислот и соотношение J1K к ИЛ К зависят от использованного штамма и от состава среды. Показано, что природный штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373 в среде с подсолнечным маслом при pH 4,5 синтезировал примерно равные количества ЛК и ИЛК, тогда как при pH 6 накапливал преимущественно ИЛК. При росте на подсолнечном масле мутантный штамм Y. lipolytica N 15 синтезировал практически одну ЛК (150 г/л), выход продукта от потребленного субстрата составлял 1,32 г/г (Kamzolova et al., 2008).
Следует отметить, что целесообразность использования основного сырья < в первую очередь определяется его пригодностью для конкретного процесса микробиологической трансформации и ценой. В настоящее время ведется поиск дешевых альтернативных источников углерода для микробиологического получения ЛК. Исследуется возможность использования отходов производства оливкового масла в качестве субстрата, для получения ЛК (Seraphim et al., 2008).
Глицерин-содержащие отходы, образующиеся при производстве биодизельного топлива, рассматриваются как перспективный субстрат для микробиологического синтеза. В связи с ростом мирового производства биодизельного топлива в больших количествах образуется глицерин в качестве побочного продукта процесса переэтерефикации растительных масел. Кроме того, технический глицерин образуется в качестве побочного продукта при производстве мыла и алкогольных напитков (Makri ct al., 2010). Основным