Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода Pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений

• Автор: Сиунова, Татьяна Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 157 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Цель и задачи исследования

Научная новизна

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биологическая роль «условно-летальных» тяжелых металлов

1.2 Токсическое влияние никеля и кобальта на живые организмы

1.3 Загрязнение почвы никелем и кобальтом

1.4 Влияние тяжелых металлов на популяцию почвенных микроорганизмов

1.5 Влияние тяжелых металлов на свойства ризосферных микроорганизмов

1.6 Поступление тяжелых металлов в клетку
1.7 Механизмы устойчивости к тяжельм металлам у бактерий
1.7.1 Связывание катионов тяжелых металлов
1.7.2 Специфические белки, участвующие в экспорте тяжелых металлов
1.8 HME-RND системы экспорта катионов тяжелых металлов
1.8.1 Механизм вывода катионов тяжелых металлов
1.8.2 Генетический контроль HME-RND систем
1.8.3 Регуляция HME-RND систем
1.8.4 Взаимодействие систем экспорта тяжелых металлов
1.8.5 Распространение HME-RND систем
1.9 Устойчивость к тяжелым металлам у Pseudomonas
1.10 Использование генетического потенциала металлоустойчивых бактерий
1.10.1 Биосенсоры
1.10.2 Биореакторы
1.10.3 Растительно-микробные ассоциации в почве, загрязненной тяжелыми металлами:
1.11 Использование устойчивых бактерий в ремедиации смешанных загрязнений
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Штаммы бактерий и плазмиды
2.2 Среды и материалы
2.3 Методы исследования
2.3.1 Условия выращивания микроорганизмов
2.3.2 Выделение бактерий, устойчивых к тяжелым металлам
2.3.3 Физиолого-биохимические тесты
2.3.4 Определение параметров роста микроорганизмов

2.3.5 Определение уровня устойчивости бактерий к тяжелым металлам
2.3.6 Эксперименты по индукции
2.3.7 Конъюгационный перенос плазмид
2.3.8 Получение электрокомпетентных клеток
2.3.9 Электропорация клеток бактерий
2.3.10 Определение стабильности плазмид
2.3.11 Выделение плазмидной ДНК
2.3.12 Выделение тотальной ДНК
2.3.13 Очистка препаратов ДНК
2.3.14 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.3.15 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.3.16 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.3.17 Препаративное выделение фрагментов ДНК из геля
2.3.18 Проведение ДНК-ДНК гибридизации
2.3.19 Секвенирование гена 16S рРНК
2.3.20 Обработка и анализ последовательности генаї 6S рРНК
2.3.21 Электроориентационная спектрометрия (ЭОС) клеток
2.3.22 Обработка клеток трипсином
2.3.23 Выделение поверхностных белков бактерий
2.3.24 Электрофорез в ДСН-ПААГ
2.3.25 Выделение и идентификация феназин-1-карбоновой кислоты
2.3.26 Тестирование антагонистической активности PGPR Pseudomonas
213.27 Определение концентрациииндольных соединений
2.3.28 Количественное определение кобальта в бактериальных клетках
2.3.29 Электронная микроскопия клеток
2.3.30 Определение активностей ключевых ферментов биодеградации нафталина
2.3.31 Определение концентрации нафталина
2.3.32 Проведение вегетационного эксперимента, моделирующего загрязнение никелем
2.3.33 Количественное определение никеля в растительных образцах
2.3.34 Проведение вегетационного эксперимента, моделирующего смешанное загрязнение
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Выделение и характеристика бактерий, устойчивых к никелю, кобальту, цинку, кадмию
3.1.2 Выявление генетических детерминант устойчивости к тяжелым металлам
3.1.3 Выяснение плазмидной локализации детерминант устойчивости
3.2 Идентификация штамма Comamonas testosteroni BS501(pBS501)

3.3 Характеристика детерминанты устойчивости плазмиды pBS501
3.3.1 Гомология с опероном cnrXYHCBATиз Cupriavidus metallidurans СН34
3.3.2 Устойчивость цитоплазматической мембраны к катионам кобальта и никеля
3.3.3 Анализ белков клеточной поверхности устойчивых штаммов
3.3.4 Индукция устойчивости к кобальту/никелю, детерминируемая плазмидой pBS501
3.4 Характеристика устойчивых к кобальту/никелю штаммов PGPR Pseudomonas
3.4.1 Создание плазмидосодержащих штаммов
3.4.2 Уровни устойчивости к тяжелым металлам
3.4.3 Стабильность плазмиды pBS501 в штаммах Pseudomonas
3.4.4 Супрессия фитопатогенов устойчивыми штаммами PGPR Pseudomonas в присутствии кобальта и никеля.:
3.4.5 Влияние тяжелых металлов на продукцию индольных соединений
3.5 Аккумуляция кобальта устойчивыми штаммами
3.6 Устойчивый ризосферный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) в вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем
3.6.1 Влияние устойчивого штамма P. aureofaciens BS1393(pBS501) на растения' при загрязнении никелем 2.5 ПДК
3.6.2 Влияние устойчивого штамма P. aureofaciens BS1393(pBS501) на растения при загрязнении никелем 5 и 10 ПДК
3.7 Устойчивые к кобальту/никелю PGPR Pseudomonas-деструкторы нафталина/фенантрена
3.7.1 Создание устойчивых штаммов-деструкторов
3.7.2 Влияние плазмидных систем устойчивости и биодеградации на рост рекомбинантных штаммов при двойном селективном давлении
3.7.3 Стабильность поддержания плазмид в рекомбинантных штаммах
3.7.4 Биодеградация нафталина устойчивыми штаммами-деструкторами в присутствии никеля
3.7.5 Штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в вегетационных экспериментах, моделирующих смешанное загрязнение
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.10.1 Биосенсоры
Для создания биосенсоров, регистрирующих тяжелые металлы были использованы регуляторные гены оперонов устойчивости. Так, например, на основе штамма Ralstonia eutropha АЕ2515, содержащего рекомбинантную плазмиду с регуляторными генами cnrYXH, слитными с биолюминисцентной репортерной lux системой, разработан биосенсор, высоко селективный для кобальта и никеля (Gorbisier, 1997; Gorbisier et al., 1999). По уровню люминесценции оценивалась концентрация биодоступного никеля в почве (Tibazarwa et al., 2001; Everhart et al., 2006).
1.10.2 Биореакторы
На адаптацию микроорганизмов к тяжелым металлам в окружающей среде влияют такие активности, как биосорбция, биопреципитация, внеклеточная секвестрация, хелатирование, механизмы вывода тяжелых металлов.
Механизм устойчивости, связанный’с выводом катионов, обеспечивает детоксикацию только цитоплазмы бактериальной клетки, и поэтому он непосредственно не может быть использован для разработки биотехнологических методов. Однако бактерии могут осуществлять биохимические реакции, такие как преципитация тяжелых металлов, например, с углекислым газом, выделяемым во время роста или деградации ксенобиотиков (Nies, 2000). Вывод катионов тяжелых металлов в штамме СН34, связанный с экспрессией оперонов спг и czc, сопровождается увеличением pH снаружи цитоплазматической мембраны, при этом, вокруг клеток образуются насыщенные зоны преципитации карбонатов металлов из среды. Это явление было использовано для извлечения металлов из сточных вод в проточном биореакторе с иммобилизованными на мембранах бактериями. Образующиеся кристаллы металлов вымывались потоком и собирались на колонке. Эта система пригодна для очистки сточных вод, содержащих кадмий, цинк, кобальт, никель и медь (Collard et al., 1994).