Создание новых хроматографических систем для выделения и очистки рекомбинантных белков с хитинсвязывающими доменами

• Автор: Курек, Денис Вячеславович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 80 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Хитин, хитозан

1.2 Свойства хитина и хитозана

1.3 Деполимеризация хитина и хитозана

1.4 Хитинолитические ферменты

1.5 Аффинная очистка рекомбинантных белков

1.6 Заключение по обзору литературы

Глава 2. Материалы, оборудование и методы исследования

2.1. Материалы и реактивы
2.2. Лабораторное оборудование
2.3. Методы получения и исследования
2.3.1. Синтез аффинных сорбентов на основе хитина
2.3.2. Синтез аффинных сорбентов на основе хитозана
2.3.3. Синтез аффинных сорбентов на основе хитозана, иммобилизированного на поливиниловом спирте
2.3.4. Получение модельных рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим доменом
2.3.5. Хроматографическая очистка рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим доменом
2.3.6. Определение ферментативной активности оксидазы Б-аминокислот
2.3.7. ПААГ-гель электрофорез в денатурирующих условиях
2.3.8. Поперечная сшивка полимеров эпихлорогидрином

2.3.9. Получение трехмерных хитиновых матриц из скелетов морских губок
2.3.10. Определение степени дезацетилирования хитозана
2.3.11. Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана
2.3.12. Оптическая, флуоресцентная и сканирующая электронная микроскопия образцов морских губок
2.3.13. ИК-спектроскогшя образцов морских губок
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Выбор материалов и стратегий для синтеза аффинных сорбентов
3.2. Иммобилизация олигомеров хитозана на поливиниловом спирте для получения аффинных сорбентов
3.3. Получение аффинных сорбентов на основе хитина
3.4. Получение аффинных сорбентов на основе хитозана
3.5. Использование различных вариантов вариантов хитинсвязывающего домена в качестве аффинного лиганда.
3.6. Хроматографические испытания и выбор оптимальной структуры сорбентов
3.7. Использование поперечной сшивки для увеличения механической прочности сорбентов
3.8. Очистка рекомбинантных белков на полученных сорбентах
3.9. Получение трехмерных хитиновых матриц из скелетов морских губок и их потенциальная возможность
использования в качестве аффинных сорбентов
ЗЛО. Сравнение полученных сорбентов с коммерческим аналогом

Выводы
Список работ по теме диссертации
Благодарности
Список литературы

инкубировалась в термостате 5 минут, далее добавляли 1 мл ЗМ раствора гидроксида натрия. Поглощение полученного раствора измерялось спектрофотометрически при 540 им. Ферментативная активность
определялась по калибровочной кривой. За единицу активности было выбрано количество В-аланина, превращаемого 1 мкл фермента в пируват за 1 минуту при 37°С.
2.3.7. ПААГ-гель электрофорез в денатурирующих условиях
Определение молекулярной массы белков в анализируемых фракциях производился методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по методу Лэммли.
2.3.8. Поперечная сшивка полимеров эпихлоргидрином
Для увеличения механической прочности сорбентов была использована поперечная сшивка эпихлогидрином. Степень сшивки расчитывли как соотношение молей эпихлоргидрина к молям звеньев ТМ-ацетилглюкозамина. К 3 г сорбента, отжатого на пористом стеклянном фильтре, расчитанные объемы эпихлоргидрина в 10 мл 0.2М раствора карбоната натрия. Реакция проводилась при перемешивании при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученные поперечносшитые сорбенты тщательно промывали 100 воды каждый.
2.3.9. Получение трехмерных хитиновых матриц из скелетов морских губок
Скелеты морских губок Ар1узша саиШоптш были предварительно промыты диализованной водой. Далее они помещались в раствор 2.5М гидроксида натрия и выдерживались при температуре 37°С в течение 48 часов. После промывки дистиллированной водой до полной нейтрализации щелочи скелеты помещались в раствор 30% уксусной кислоты при