Разработка идентификации Bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов

• Автор: Мастиленко, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 144 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологические свойства Bordetella bronchiseptica и характеристика заболевания

1.1.1. Таксономия

1.1.2. Эпизоотология

1.1.3. Морфология и тинкториальные свойства

1.1.4. Биохимические свойства

1.1.5. Геном

1.1.6. Культивирование

1.1.7. Антигенная характеристика
1.1.8. Патогенез
1.1.9. Инфекционный цикл
1.2. Лабораторные методы диагностики бордетеллеза
1.2.1. Иммунохимические методы
1.2.2. Молекулярно-генетические методы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект, материалы и методы исследований
2.1.1. Штаммы
2.1.2. Питательные среды и реактивы
2.1.3. Оборудование
2.1.4. Животные
2.1.5. Методы
2.2. Результаты исследований и их обсуждение
2.2.1. Сравнительный анализ иммунохимических методов для изучения антигенного состава В. bronchiseptica
2.2.1.1. Получение антигенов В. bronchiseptica
2.2.1.2. Получение гипериммунной сыворотки
2.2.1.3. Определение титра гипериммунной сыворотки
2.2.1.4. Двойная радиальная иммунодиффузия антигенов В. bronchiseptica по методу О. Ouchterlony (1948)
2.2.1.5. Встречный электрофорез по методу G. Bedarida et al. (1969).
2.2.1.6. Иммуноэлектрофорез антигенов В. bronchiseptica по
методу Р. Grabar и C. Williams, описанному X. Фримсль (1979)
2.2.2. Разработка методики молекулярно-генетической идентификации В. bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции
2.2.2.1. Идентификация участков генов В fr А и BfrZ генома
В. bronchiseptica
2.2.2.2. Идентификация участков генов Cytochrom—С—oxidase и 16S rRNA, специфичных для представителей рода Bordetella
2.2.2.3. Использование ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для индикации и количественного определения содержания ДНК В. bronchiseptica в биологическом материале с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green
2.2.2.4. Использование мультиплексного формата ПЦР для идентификации В. bronchiseptica
2.2.2.5. Определение чувствительности ПЦР для идентификации В. bronchiseptica с разработанными системами праймеров
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
А - ангстрем
АДФ - аденозиндифосфат
ГЭ - геном-эквивалент
ГЭ/мкл - геном-эквивалент на 1 мкл
ГЭ/мл - геном-эквивалентов на 1 мл
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
КОЕ - колониеобразующие единицы
КОЕ/мл - колониеобразующих единиц на 1 мл
мкл - микролитр
мл — миллилитр
п.н. — пар нуклеотидов
п.о. - пар оснований
пг - пикограмм
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РА - реакция агглютинации
РДП - реакция диффузной преципитации
РНК - рибонуклеиновая кислота
РСК - реакция связывания комплемента
РПГА — реакция прямой гемагглютинации
цАМФ — циклический аденозинмонофосфат
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay
kDa - килодальтон
Tm - температура плавления
pmol - пикомоль

ультразвука бактериальных клеток В. pertussis, было идентифицировано до 12 антигенных комплексов.
Большинство исследователей описывают эксперименты, касающиеся антигенных различий трех представителей рода Bordetella: В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica. Е.К. Andersen [25] и, позднее, G. Eldering et al. [65] описали конкретные видо- и родоспецифичные термолабильные и термостабильные антигены, выявляемые в реакциях агглютинации. Так в их работах показано, что в состав капсульного слоя входят поверхностные агг-лютиногены, легко обнаруживаемые даже у молодых культур. Немаловажной деталью является то, что эти агглютиногены легко снимаются с поверхности клеток бордетелл с использованием достаточно простых технологии -многократной отмывки и последующего концентрирования, с применением сульфата аммония или сульфата натрия. Однако при дальнейшем исследовании авторы указывают на слабые протективные свойства этих антигенов. Такие же данные представили в своих работах G.S. Wilson and A. Miles [206].
Позднее R. Ross et al. в 1969 году исследовал антигенный состав В. pertussis, В. bronchiseptica и В. parapertussis с помощью методов диффузной преципитации в агаровом геле и иммуноэлектрофореза в барбитуратовом буфере. Антигены были получены путем экстрагирования лизированных культур в щелочном солевом буфере. При сравнении результатов полученных после преципитации в геле антигенных структур этих видов бордетелл с антисывороткой к В. pertussis оказалось, что как минимум три антигена являются общими [175].
N. Holby et al. [97] продемонстрировали в своих исследованиях с помощью количественных методов иммуноэлектрофореза перекрестные реакции между антигенами В. pertussis и 28 другими видами бактерий. В опытах были использованы антигены бактерий, полученные при помощи ультразвука, и иммунная кроличья сыворотка. Только два антигена В. pertussis из 44 выделенных давали перекрестную реакцию с представителями других видов, в основном грамотрицательными бактериями. Однако оказалось, что антиге-