Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli

• Автор: Крякунова, Елена Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ЕЕНуклеазы

1Л Л. Нуклеаза Serratia marcescens

1Л .2. Нуклеаза АпаЪаепа sp

. 1.2. Ферменты, участвующие в структурной организации ДНК

(топоизомеразы)

1.2Л. ДНК-гираза

1.3. Клонирование генов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы исследования
2.2. Получение компетентных клеток
2.3. Трансформация компетентных клеток методом теплового шока
2.4. Выделение плазмидной ДНК
2.5. Электрофорез в агарозном геле
2.6. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных
вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA
2.7. ЖУ-электрофорез в полиакриламидном геле
2.8. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA с помощью индикаторного агара
2.9. Определение динамики роста рекомбинантных штаммов
E.coli LK111А и E.coli TGE900
2.10. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт
2.11. Реакция рестрикции
2.12. ДНК-лигазная реакция
2.13. Амплификация фрагментов гена Ыа с помощью ПЦР
2.14. Определение минимальной ингибирующей
концентрации антибиотика '
2.15. Определение количества ß-лактамазы
2.16. Определение частоты спонтанной элиминации плазмид
2.17. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение рекомбинантных штаммов
' E. coli LK111A и E. coli TGE900
3.2. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных
вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp
3.3. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp.
с помощью индикаторного агара
3.4. Влияние базального уровня экспрессии генов исходных

и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens
и АпаЪаепа sp. на выживаемость рекомбинантных штаммов
E. coli LK111A и E. coli TGE900
3.5. Определение уровня устойчивости к ампициллину для
рекомбинантных штаммов E. coli LK11IA и E. coli TGE900
3.6. Получение референс-плазмидырЕТсосоАтрСт
3.6.1. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт
на основе плазмиды рЕТсосоСт
3.6.2. Определение дозы гена Ыа в рекомбинантном штамме
E.coli DH5a рЕТсосоАтрСт
3.7. Определение количества генов Ыа в рекомбинантных штаммах
E.coli LK111A и E.coli TGE900
3.8. Определение стабильности наследования плазмид
pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах
E. coli LK111A и E. coli TGE900
3.9. Определение устойчивости рекомбинантных штаммов
E.coli LK11IX и E. coli TGE900 к антибиотикам
ингибиторам репликации ДНК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АДФ (ADP) - аденозиндифосфат.
АТФ (АТР) - аденозинтрифосфат.
ГМФ - гуанозин-5’-монофосфат.
КОЕ - колониеобразующие единицы.
ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция.
ПЭГ - полиэтиленгликоль (макрогол, полиэтиленоксид, ПЭО) - полимер этиленгликоля (этиленоксида).
УМФ — уридин-5’ -монофосфат.
ФЭК — фотоэлектрокалориметр.
цАМФ - циклический адепозинмонофосфат.
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.
А — аденин.
А2В2 — тетрамер ДНК-гиразы.
AA/Bis (29:1) - бисакриламид.
Ala (А) - аланин.
Amp - ампициллин.
APS {Ammonium pyrosulfate) - пиросульфат аммония (NH4)2S207.
Ara - арабиноза.
ага A, araB, araD - гены araBAD- оперона.
АгаС - белок-регулятор Р/ас-промотора.
Arg (R) - аргинин.
As a (N) - аспарагин.
Asp (D) - аспарагиновая кислота.
В - Т, G или С.
bla - ген ß-лактамазы.
BstZl 71 - рестрикционный сайт для рестриктазы BstZ171.
С - цитозин.
C1/C1S57 — исходная/мутантная форма белка-репрессора /ф,-промотора фага X. CAP {catabolism activating protein) — белок, активирующий катаболизм.

cop Cl работоспособен и при температуре в 42°С.
В настоящее время также широко используются плазмидные векторы, количество копий которых регулируется за счет присутствия или отсутствия в среде углеводных субстратов, в частности, глюкозы и арабинозы. Плазмида рЕТсосоСт является такой векторной системой с уникальной регуляцией ко-пийности плазмиды от одной до 40 копий на клетку в зависимости от содержания в среде углеводного субстрата [Friehs, 2004], что полезно при клонировании в плазмиде трансгенов, продукты которых токсичны для клеток-хозяев.
Двойной контроль экспрессии генов [Wild et al., 2004] вектора рЕТсосоСт основан на двух альтернативных точках начала репликации oriS и oriV [Jones et al., 1998; Novy et al., 2002]. Этот вектор также характеризуется наличием в его составе очень сильного Д/,„ -промотора, контроль которого осуществляется с помощью арабинозы [Haldimann et al., 1998; Friehs, 2004]. Кроме того, в состав этой плазмиды входят ген-репликатор repE [Diaz-Lopez et al., 2003] и гены рагАВ, чьи продукты действуют в oriS. Также в плазмиде находятся ген рагС (обеспечивает низкокопийность) и ген-репликатор trfA [Konieczny et al., 1997], белки которого прикрепляются к повторяющимся последовательностям в 17 п.о. на 5'-конце oriV. OriS является конститутивной точкой начала репликации, действующей в отсутствии условий для индукции. В отличие от нее, oriV представляет собой факультативную точку начала репликации, контроль которой осуществляется с помощью находящихся в среде углеводных субстратов [Jones et al., 1998; Sektas et al., 2002].
При наличии в питательной среде глюкозы, которая легко усваивается клеткой, белок RepE активирует точку oriS, запуская процесс репликации, которая продолжается до тех пор, пока в среде есть глюкоза. При низком содержании глюкозы в среде (от 0,2% до 0,5%) белок RepE связывается с локу-сом copA/incC, что приводит к слиянию oriS с локусом copA/incC, при этом происходит ингибирование процесса репликации [Zzaman et al., 2005; Nordstrom et al., 2006]. Пока в среде содержится лишь глюкоза, /,с-промотор,