Регио- и стереоспецифическое гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положении 7 мицелиальными грибами

• Автор: Лобастова, Татьяна Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Микробиологическое гидроксилирование стероидных соединений

2.1.1 7(а/р)-гидроксилирование стероидных соединений мицелиальными грибами

2.1.2 Дигидроксилирование стероидов в положения 7а и 15а мицелиальными грибами

2.1.3 Функционализация кольца D мицелиальными грибами

2.2 Дегидроэпиандростерон и его производные

2.2.1 Дегидроэпиандростерон и его производные, их роль в организме человека и животных

2.2.2 Гидроксилирование ДГЭА мицелиальными грибами

2.2.3 Способы получения дегидроэпиандростерона и его гидроксилированных производных
2.2.3.1 Получение ДГЭА
2.2.3.2 Химический синтез 7(а/р)-гидроксипроизводных ДГЭА
2.2.3.3 Преимущества микробиологического метода получения гидроксилированных стероидов.
2.2.4 Ферменты, катализирующие процессы гидроксилирования дегидроэпиандростерона
2.3 Факторы, влияющие на процесс гидроксилирования стероидов мицелиальными грибами
2.3.1 Влияние состава питательной среды
2.3.2 Влияние возраста культуры и величины биомассы
2.3.3 Влияние pH и температуры
2.3.4 Влияние способа внесения стероида в трансформационную среду
2.3.5 Индукция стероидных гидроксилаз
2.4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1.1 Реактивы
3.1.2 Микроорганизмы и их культивирование
3.1.3 Трансформация ДГЭА грибными культурами
3.1.4 Биоконверсия ДГЭА Fusarium graminearum F-159 в ростовых условиях
3.1.5 Биоконверсия ДГЭА Gibberella zeae ВКМ F-2600
3.1.5.1 Выращивание G. zeae ВКМ F-2600 и биоконверсия ДГЭА отмытым мицелием
3.1.5.2 Выращивание G. zeae ВКМ F-2600 и биоконверсия ДГЭА в ростовых условиях
3.1.5.3 Оптимизация условий 7а-гидроксилирования ДГЭА G. zeae ВКМ F-2600
3.1.5.4 Трансформация ДГЭА G. zeae ВКМ F-2600 в ферментере АНКУМ 2М
3.1.6 Аналитические методы
3.1.7 Масс-спектрометрия
3.1.8 'Н-ЯМР- и 13С-ЯМР спектроскопия
3.1.9 Химический синтез Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-она (7-дегидро-ДГЭА) из 7а-ОН-ДГЭА
3.1.9.1 Получение 0-3[3-трет-бутилдиметилсилилокси-7а-гидроксиандрост-5-ен-17-она и его характеристика
3.1.9.2 Получение 1>3[3-трет-бутилдиметилсилилокси-7а-хлор-андрост-5-сн-17-она и и его характеристика
3.1.9.3 Получение 0-Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-она (7-дегидро-ДГЭА)

и его характеристика
Методы анализа стероидных соединений, полученных при химическом синтезе
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Трансформация ДГЭА мицелиальными грибами 7а-Г идроксилирование ДГЭА 7Р-Гидроксилирование ДГЭА 7а,15а-Дигидроксилирование ДГЭА
Связь 7-гидроксилирования с сопутствующими реакциями трансформации дегидроэпиандростерона: 17р-восстановлением,
окислением 3-гидроксигруппы и Д5_*4-изомеризацией, лактонизацией по кольцу Д
Оптимизация процесса 7а,15а-дигидроксилирования ДГЭА штаммом
F. graminearum F-159 в ростовых условиях
Особенности процесса 7а,15а-дигидроксилирования ДГЭА при различных способах внесения субстрата
Биоконверсия ДГЭА штаммом F. graminearum F-159 в присутствии

Влияние времени внесения субстрата на 7а,15а-дигидроксилирование ДГЭА F. graminearum F-
Трансформация ДГЭА штаммом F. graminearum F-159 в ферментёре АНКУМ2М
Химико-микробиологический синтез Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-она из ДГЭА
Оптимизация процесса получения 7а-ОН-ДГЭА из ДГЭА отмытым мицелием G. zeae ВКМ F-2
Влияние источников углерода и азота на 7а-гидроксилирование ДГЭА
G. zeae ВКМ F-2
Зависимость 7а-гидроксилазной активности G. zeae ВКМ F-2600 от значения pH
Зависимость 7а-гидроксилазной активности G. zeae ВКМ F-2600 от возраста и величины биомассы
7а-Гидроксилирование ДГЭА G. zeae ВКМ F-2600 в средах с органическими растворителями
Влияние ПАВ на 7а-гидроксилазную активность G. zeae ВКМ F-2600 Влияние концентрации субстрата на 7а-гидроксилирование ДГЭА G. zeae ВКМ F-2
Индукция 7а-гидроксилазной системы штамма G. zeae ВКМ F-2600 Трансформация ДГЭА штаммом G. zeae ВКМ F-2600 в присутствии МЦД в ростовых условиях
Трансформация ДГЭА до 7а-ОН-ДГЭА штаммом G. zeae ВКМ F-2600 в ферментёре АНКУМ 2М
Химическая конверсия 7а-ОН-ДГЭА в 7-дегидро-ДГЭА ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ 1: Акт испытаний способа микробиологического дигидроксилирования Зр-гидроксиандрост-5-ен-17-она с образованием Зр,7а,15а-тригидроксиандрост-5-сн-17-она штаммом Fusarium graminearum F-
ПРИЛОЖЕНИЕ 2: Акт испытаний способа микробиологического 7а-гидроксилирования 3 [3-гидроксиандрост-5-ен-17-она с образованием Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она культурой G. zeae ВКМ F-2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АД - андросхендион (андрост-4-ен-3,17-дион)
АДЦ - андростадиендион (андроста-1,4-диен-3,17-дион)
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГЖХ - газо-жидкостная хроматография
ДГЭА — дегидроэпиандростерон (3 Р-гидроксиандрост-5-ен-17-он)
ДГЭАС - сульфат дегидроэпиандростерона
1а-ОН-ДГЭА-1а-гидроксидегидроэниандростерон (1 а,3 Р-дигидроксиандрост-5-ен-17-он) 7а-ОН-ДГЭА-7а-гидроксидегидроэпиандростерон (Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-он) 7р-ОН-ДГЭА-7р-гидроксидегидроэпиандростерон (Зр,7р-дигидроксиандрост-5-ен-17-он) 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА - 7а,15а-дигидроксидегидроэпиандростерон (Зр,7а,15а-тригидроксиандрост-5-ен-17-он)
7-дегидро-ДГЭА - 7-ен-дегидроэпиандростсрон (ЗР-гидроксиандроста-5,7-диен-17-он) 11а-ОН-ДГЭА - 11а-гидроксидегидроэпиандростерон (ЗР,1 1 а-дигидроксиандрост-5-ен-17-он)
7р,11а-ди-ОН-ДГЭА-7Р,11а-дигидроксидегидроэпиандростерон (ЗР,7р,Па-тригидрокси-андрост-5-ен-17-он)
16а-ОН-ДГЭА - 16а-гидроксидегидроэпиандростерон (Зр,16а-дигидроксиандрост-5-ен-17-он)
16а-ОН-АД - 1 ба-гидроксиандростендион (16а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион)
ДМСО - диметилсульфоксид ДМФА - диметилформамид
ДТ - 1(2)-дегидротестостерон (17Р-гидроксиандроста-1,4-диен-3-он) кссв — константа спин-спинового взаимодействия МИД - метилированное производное р-циклодекстрина МС - масс-спектрометрия
Т-тестостерон (17р-гидроксиандрост-4-ен-3-он)
ТГФ - тетрагидрофуран
тех - тонкослойная хроматография
ХФ - хлорамфеникол
ОД - циклодекстрин
ЦГ - циклогексимид
ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

2.3.2 Влияние возраста культуры и величины биомассы
Детальное исследовавние 11-гидроксилирования прогестерона Rh. nigricans показало, что эффективность биоконверсии зависела от использования глобулярного мицелия в активной фазе роста, полученного при высокой скорости перемешивания и небольшого объёма инокулята. Высокий выход продукта - свыше 90 % - при концентрации субстрата 0.3 г/л был получен в периодических условиях культивирования (Znidarsic et al., 1998).
Для С. lunata ВКМ F-644 было показано, что наиболее высокую lip-гидроксилазную активность при трансформации кортексолона мицелий проявлял в фазе замедления роста и в стационарной фазе, при этом мицелий в стационарной фазе роста характеризовался высоким содержанием белка, стабильным содержанием РНК и ДНК (Ангелова с соавт., 1986). Однако другими авторами было показано, что в отношении того же субстрата мицелий С. lunata проявлял максимальную 11 p-гидроксилазную активность в конце логарифмической стадии, а на более поздних стадиях развития мицелия показывал повышенную 14сс-гидроксилазнуго активность (Ядерец с соавт., 2007).
Эффективность проведения процесса гидроксилирования также может зависеть от количества используемой биомассы (Габинская, 1970; Могильницкий 1970). В некоторых случаях количество используемой биомассы увеличивали в десятки раз - от 0.2 г/л для Rh.nigricans при lla-гидроксилировании прогестерона и 1 ба-гидроксипрогестерона (Габинская с соавт., 1972) до 7.0 г/л для Т. orchidis при 11а- и 11 р-гидроксилировании кортексолона (Могильницкий, 1970). При трансформации АД культурой С. lunata количество мицелия варьировали от 7 до 18 г/л среды. Биомасса, равная 10 г/л среды была оптимальной при конверсии субстрата в концентрации 4 г/л, а биомасса 12 г/л среды - при трансформации субстрата 6 г/л. Дальнейшее увеличение биомассы не влияло на выход 14а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона (Шувалова с соавт., 2001).
2.3.3 Влияние pH и температуры
На рост и гидроксилазную активность мицелиальных грибов большое влияние оказывало значение pH среды. Многочисленные исследования показали, что оптимальное значение pH при проведении биоконверсии стероидов грибами находилось в пределах от
4.0 до 7.0 (Суходольская с соавт., 1996; Wang et al., 1998; Xionga et al., 2006). Изменение pH среды влияло не только на количественный, но и на качественный состав гидроксилированных продуктов. При проведении трансформации АД грибом Beauveria bassiana AF206001 при pH среды 6.0 и 7.0 наблюдалось образование разных гидроксилированных соединений. При pH 6.0 среды были получены два