Разработка ПЦР-тест-систем для идентификации парвовируса и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней

• Автор: Козлова, Александра Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Парвовирусная инфекция свиней (ПВИС)
1.1 Клинические признаки
1.2 Пути передачи
1.3 Патогенез
1.4 Характеристика возбудителя
Классификация
Морфология и геном вируса
Устойчивость
Антигенная вариабельность
Патогенность
1.5 Диагностика ПВИС
2. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС)
2.1 Клинические признаки
2.2 Пути передачи
2.3 Патогенез
2.4 Характеристика возбудителя
Классификация
Морфология и химический состав
Устойчивость
Организация генома РРСС
Генетическая вариабельность вируса РРСС
2.5 Диагностика РРСС
3. Заключение по обзору литературы
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований
4.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе
4.2. Биологический материал, использованный в работе
4.3. Проведение ПЦР-анализа
4.3.1. Экстракция НК методом осаждения изопропанолом
4.3.2. Экстракция НК наборами Qiagen
4.3.3. Проведение ПЦР (ПВС) и ОТ-ПЦР (вирус РРСС)
4.4. Клонирование ДНК и кДНК в плазмиду рвЕМ^
4.5. Клонирование ДНК в фаг А^ПО
4.6. Очистка продуктов ПЦР
4.7. Секвенирование
4.8. Проведение филогенетического анализа
Результаты исследований
5. Разработка тест-системы для выявления ДНК парвовируса
свиней

5.1. Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции ДНК ПВС
5.2. Анализ специфичности работы олигонуклеотидов
5.3. Подбор оптимальных условий амплификации
5.4. Введение контрольных образцов
5.5. Анализ чувствительности тест-системы
6. Разработка тест-системы для выявления и генотипировання вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней
6.1. Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции РНК вируса РРСС
6.2. Анализ специфичности работы олигонуклеотидов
6.3. Подбор оптимальных условий амплификации
6.4. Введение контрольных образцов
6.5. Анализ чувствительности тест-системы
7. Выбор метода экстракции нуклеиновых кислот
7.1. Подбор условий экстракции НК из спермы с использованием метода осаждения изопропанолом
7.2. Использование наборов Qiagen
8. Исследование вакцин против РРСС
9. Исследование биологического материала от свиней
9.1. Обнаружение образцов, содержащих ДНК! ПВС
9.2. Обнаружение образцов, содержащих РНК вируса РРСС
9.3. Расследование вспышек, вызванных вирусом РРСС
9.4. Секвенирование образцов, содержащих РНК вируса РРСС
9.5. Филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ в 2009-2013гг
9.6. Анализ образцов на наличие смешанных инфекций
10. Проведение комиссионных испытаний
11. Сравненительный анализ чувствительности и специфичности наборов для выявления ДНК ПВС
11.1. Сравнение с набором реагентов № 1 (производство Россия)..
11.2. Сравнение с набором реагентов №2 (производство Россия)..
12. Сравненительный анализ чувствительности н специфичности наборов для выявления РНК вируса РРСС
12.1. Сравнение с наборами реагентов №1 и №2 (производство Россия)
12.2. Сравнение с набором реагентов №3 (производство Россия)..
12.3. Сравнение с набором реагентов №4 (производство Франция).
ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
BHQ Black Hole Quencher
FRT Fluorescent Real-Time
LAMP NCBI loop-mediated isothermal amplification National Center for Biotechnology Information - Национальный центр биотехнологической информации
ORF ОТ-LAMP open reading frame (открытая рамка считывания) loop-mediated isothermal amplification с обратной транскрипцией
РАМ porcine alveolar macrophages
PBS phosphate buffer solution
PPV porcine parvovirus
PRSSV porcine reproductive and respiratory syndrome virus
RFLP restriction fragment length polymorphism
TaqF Thermus aquaticus
BKO внутренний контрольный образец
днк дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат
ИФА иммуноферментный анализ
кДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
к+ положительный контрольный образец
к- отрицательный контрольный образец этапа амплификации
коп/мл количество копий НК в мл
КК культура клеток
НК нуклеиновые кислоты
н.п. нуклеотидных пар
ОКО отрицательный контрольный образец этапа экстракции НК
ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ПВС парвовирус свиней
пвис парвовирусная инфекция свиней
«Laboratorios Hipra S.A.», Испания;
5. Вакцина «Прогрессис» против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, инактивированная, эмульгированная (шт. Р120 европейского генотипа), «Merial», Франция;
6. Вакцина «Порцилис PRRS» против репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) живая сухая (гит. DV европейского генотипа), «Intervet International B.V.», Нидерланды;
7. Шт. NADC-8 американского генотипа.
Цирковирус свиней 2 типа (PCV-2)
НПО «Нарвак», г. Москва
Вирус болезни Ауески (ADV)
шт. ГНКИ, Арский, МБА
Вирус классической чумы свиней (CSFV)
шт. Синлак, ГМ-94, ЛК-ВНИИВМ
Вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV)
НПО «Нарвак», г. Москва
Ротавирус тип А
шт. РП-
Кроме вакцинных штаммов оценку специфичности тест-систем
проверяли на НК из образцов биоматериала от животных, инфицированных
вирусом африканской чумы свиней (ASV) и вирусом эпидемической диареи
(PEDV). Использовали также штаммы и изоляты бактерий: Mycoplasma
hyopneumonia, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynovia; Brucella suis;
Chlamydia suis; Chlamydophila peconim; Haemophilus parasuis; Lawsonia
intracellularis; Actinobacillus pleuropneumoniae; Bordetella bronchiseptica;
Pasterella multocida; Leptospira interrogans; Listeria monocytogenes;
Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium;
Escherichia coli; Campylobacter jejuni; Salmonella choleraesuis; Salmonella
Dublin, Staphylococcus aureus; Yersinia enterocolitica, Yersinia
pseudotuberculosis, Streptococcus suis, Clostridium perfringens, Klebsiella
pneumoniae.