Разработка методов диагностики инфекции, вызываемой Mycoplasma hyopneumoniae

• Автор: Бирюченкова, Марина Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 134 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АБТС - 2,2-азино-ди-(-3-эпшбензтиазолинсульфонат)
БКП - белок-кодиругащая последовательность
а.о. - аминокислотный остаток БСА - бычий сывороточный альбумин БКП - белок-кодирующая последовательность
ВНИИЗЖ - Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных
ГГЦ - гуанидинизотиоцианат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН - додецююульфат натрия
ШМГ - изопропилтио-Р-О-галактопираиозид
ИФА - иммуноферментный анализ
КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер
МАТ - моноклональные антитела
мПЦР - мультиплексная полимеразная цепная реакция
НРИФ - непрямая реакция иммунофлюоресценции
ОП - оптическая плотность
ОРС - открытая рамка считывания
ПААТ - полиакриламидный гель
ПВИС - парвовирусная инфекция свиней
н-ИФА - непрямой вариант иммуноферментного анализа
н. п. - нуклеотидные пары
ПИП - позитивно-негативный порог
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени
РИГА - реакция непрямой гемагглютинации
РНИФ—реакция непрямой иммунофлюоресценции
РРСС - репродуктивно-респираторный синдром свиней
РСК - реакция связывания комплемента
РСКС - респираторный симптомокомплекс свиней
ТБЕ - трис-боратный буфер
ФБР - фосфатно-буферный раствор
ЦВС-2 - цирковирус свиней второго типа
ЭДГА - этилендиаминтетраацетоуксусная кислота
ЭП—энзоотическая пневмония
dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат
IDEXX-ИФА - иммуноферментный анализ, проведенный с использованием
коммерческого набора фирмы IDEXX
М. hyopneumoniae — Mycoplasma hyopneumoniae
PBST - фосфатно-солевой буфер с твином
SPF —животные, свободные от специфических патогенов

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Возбудитель энзоотической пневмоний свиней
l'.l.l. Xаксономическое и филогенетическое положение
1.1.2. Морфология и строение
1.1.2.1. Структура микоплазмы
1.1.2.2. Геном Mycoplasma hyopneumoniae
1.2. Общая характеристика энзоотической пневмонии свиней
1.2.1. Патогенез
1.2.2. Клиническая картина заболевания
1.2.3. Патологоанатомические изменения
1.2.4. Иммунитет и специфическая профилактика
1.3. Диагностика энзоотической пневмонии свиней
1.3.1. Обнаружение Mycoplasma hyopneumoniae
1.3.2. Методы молекулярного типирования
1.3.3. Обнаружение антител к Mycoplasma hyopneumoniae
1.4. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Патологический материал
2.1.2. Штаммы микроорганизмов
2.1.3. Сыворотки крови
2.1.4. Бактериальные штаммы для рекомбинантных плазмид
2.1.5. Плазмиды
2.1.6. Реактивы
2.1.7. Ферменты
2.1.8. Среды и растворы
2.1.9.,Пероксидазный конъюгат
2.1.10. Прочие материалы
2.1.11. Оборудование
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение нуклеиновых кислот
2.2.2. Расчет и синтез праймеров
2.2.3. ПЦР для обнаружения ДНК Mycoplasma hyopneumoniae
2.2.4. Очистка продуктов ПЦР
2.2.5. ПЦР-РВ для обнаружения ДНК Mycoplasma hyopneumoniae
2.2.6. Нуклеотидное секвенирование
2.2.7. Анализ первичной структуры нуклеиновых кислот
2.2.8. Молекулярное клонирование продуктов ПЦР
2.2.9. Экспрессия рекомбинантных белков
2.2.10: Очистка рекомбинантных белков
2.2.11. Непрямой вариант ИФА
2.2.12. Коммерческие наборы
2.2.13. Статистическая обработка результатов
2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
2.3.1. Разработка ПЦР для выявления ДНК Mycoplasma hyopneumoniae
2.3.2. Применение ПЦР в диагностических исследованиях
2.3.2.1. Исследование патологического материала от свиней
2.3.3. Разработка ПЦР в реальном времени для количественного обнаружения ДНК Mycoplasma hyopneumoniae
2.3.4. Филогенетическая характеристика полевых изолятов Mycoplasma hyopneumoniae
2.3.5. Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантного белка Mycoplasma hyopneumoniae для выявления антител в сыворотке крови
2.3.5.1. Получение рекомбинантного белка Mycoplasma hyopneumoniae в системе экспрессии E. coli
2.3.5.2. Разработка непрямого варианта ИФА методом последовательных-разведений сывороток крови
Таблица
Варианты ПЦР-анализа для выявления ДНК М. hyopneumoniae
ссылка Тип ПЦР Ампликон предел чувствительности используемые образцы
ген длина (п.п.)
Harasawa et al. (1991) С повторяющаяся неизвестная последовательность 520 5 нгилиТООО КОЕ/мл неизвестно
Artiushin et al. (1993) с уникальный гипотетический'ген 456 1-10 пг ДНК бронхиальные смывы, легочная ткань
Stemke et al. (1994) с 16S рРНК 200 1000 геномных копий неизвестно
Mattsson et al. (1995) с 16S рРНК 649 5 КОЕ носовые истечения
Blanchard et al. (1996) с переносчик ABC 1561 500 фг трахеобронхиальные смывы
Stark et al. (1998) г повторяющийся элемент MHYP1-03-950 808 1 клетка бронхиальные смывы
Baumeister et al. (1998) с неизвестно 853 100 КОЕ/мл бронхиальные смывы
Calsamiglia et al. (1999) г 16S рРНК 352 80 клеток носовые истечения
Verdin et al. (2000) г переносчик ABC 706 1 фг трахеобронхиальные смывы, носовые истечения
Caron et al. (2000) с межгенная последовательность (рЗб) 948 50 пг трахеобронхиальные смывы, легочная ткань
с межгенная последовательность (р46) 580 0,5 нг носовые истечения
м рЗб и р46 948 и 580 неизвестно трахеобронхиальные смывы, легочная ткань, носовые истечения
Kurth et al. (2002) г уникальный гипотетический ген 240 0,5-1,0 фг трахеобронхиальные смывы
Dubosson et al. (2004) PB повторяющийся элемент MHYP1-03-950 808 1 фг бронхиальные смывы
1-141-фрагмент переносчика ABC 706 1 фг бронхиальные смывы
Sibila et al. (2004) PB транспозон 137 103 КОЕ/мл носовые смывы
Tpi 88 103 КОЕ/мл носовые смывы
Stakenborg et al (2006) м lôSpPHK 1000 1 пг неизвестно
Cai et al. (2007) с 16S рРНК 649 0,18 КОЕ/г легочная ткань
Примечание: С - стандартная ПЦР; Г - гнездовая ПЦР; М - мультиплексная ПЦР; PB — ПЦР в реальном времени.