Выявление липид-белковых микродоменов (рафтов) на вакуолярной мембране

• Автор: Нестеркина, Ирина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список используемых сокращений
Введение
I. Обзор литературы
1. Общая характеристика вакуолярной мембраны
2. Особенности липидного и белкового состава тонопласта
2.1. Липидный состав вакуолярной мембраны
2.2. Жирные кислоты тонопласта..:..г
2.3. Белковый состав тонопласта
3. Липид-белковые микродомены - рафты
3.1. Развитие концепции о рафтах
3.2. Структура рафтов
3.2.1. Липиды рафтов
3.2.2. Белки рафтов
3.3. Функции рафтов
3.4. Механизмы формирования рафтов
3.5. Локализация рафтов
4. Обзор методов выделения рафтов
5. Выводы из обзора литературы. Цели и задачи работы
II. Материалы и методы исследования
1. Характеристика объекта исследования
2. Выделения изолированных вакуолей и вакуолярных мембран
3. Инфракрасная спектроскопия
4. Изучение и идентификация липидов тонопласта и микродоменов при помощи тонкослойной хроматографии
5. Изучение жирнокислотного состава тонопласта и микродоменов
6. Определение белка по методу Бредфорд
7. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия по Лэммли

8. Иммуноблоттинг (Вестерн-блотинг)
9. Флуоресцентная микроскопия
10. Конфокальная микроскопия
11. Статистический анализ
12. Использованные реактивы
III. Результаты и их обсуждение
1. Выявление стерин-обогащенных микродоменов методом флуоресцентной микроскопии
2. Изоляция липид-белковых микродоменов с использованием разных методов
2.1. Метод выделения рафтов с детергентом Тритоном Х
2.2. Метод выделения рафтов без детергентов
3. Обнаружение липид-белковых микродоменов методом конфокальной микроскопии
4. Сравнительный анализ ИК - спектров липидных микродоменов вакуолярных мембран с тонопластом
5. Изучение белкового состава рафтов тонопласта
6 Изучение липидного состава микродоменов тонопласта
7. Жирнокислотный состав микродоменов тонопласта
IV. Заключение
V. Выводы
VI. Список литературы

Список используемых сокращений
БСА - бычий сывороточный альбумин ДДС-Na - додецилсульфат натрия ИДС - индекс двойных связей ДМСО - диметилсульф оксид ИК-спектроскопия - инфракрасная спектроскопия
-= -ЖК -жирные КИСЛОТЫ
кДа - килодальтон
ПААГ - полиакриламидный гель
РОБ - рафт-образующие белки
Тп - температура плавления
Тф.п. - температура фазового перехода
ФЛ - фосфолипиды
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЯМР - метод ядерномагнитного резонанса
ECL - индекс эквивалентной длины алифатической цепи
Hf-АТФаза - Н+-аденозинтрифосфотаза
РГ-ПФаза - РГ-пирофосфотаза
LB - высокоупорядоченная фаза мембраны
Lc - жидкокристаллическая фаза мембраны
10 - жидкоупорядоченная фаза мембраны
ld - жидконеупорядоченная фаза мембраны
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
TBS - трис-солевой буфер
TTBS - твин содержащий трис-солевой буфер
Rf- длина пробега вещества (расстояние от точки старта до центра пятна)

жидкоупорядоченная (L0). В этой фазе жирнокислотные цепи липида упакованы так же плотно, как в гелевой, но имеют большую мобильность, благодаря внедрению молекул холестерина между сфинголипидами. Предполагается также, что холестерин может локализоваться вдоль границы между сфинголипидными доменами и глицерофосфолипидами, создавая переходную зону между L0 и Lc фазами (Brugger et al., 2000).
В образовании рафтов играет роль трансбислойная и латеральная ассиметрия молекул отдельных липидов, которая считывает форму каждого мембранного липида и даёт возможность совместного существования внутри мембраны различных липидных фаз Lc и L0 (Pomorski et al., 2001; Kol et al., 2003).
Концепция рафтов в клеточных мембранах как островков новой фазы получила мощную поддержку со стороны экспериментов с модельными липидными мембранами - гигантскими липосомами и плоскими бислоями. В таких системах после понижения температуры в результате фазового перехода образуются рафты диаметром более 500 нм, которые легко наблюдать методами флуоресцентной микроскопии (Simons et al., 2004; Kaiser et al., 2009).
3.5. Локализация рафтов
Липидные домены впервые были обнаружены в фибробластах человека и хомяка как детергентнерастворимый гликопротеинный матрикс, обогащенный гликосфинголипидами (Anderson, Jacobson, 2002).
В настоящее время в растениях рафты обнаружены в клетках арабидопсиса (Arabidopsis thaliana L.) и клетках проростков лука (Allium porrum L.) на плазматической мембране и аппарате Гольджи (Laloi et al., 2007). Также найдены микродомены на плазматической мембране листьев табака (Nicotiana tabacum L.) (Morel et al., 2006), на плазматической мембране корней люцерны (Medicago truncatula L.) (Lefebre et al., 2007). В клетках животных и дрожжей