Ферментативная регуляция SS/SH редокс статуса запасных белков и качества клейковины пшеницы

• Автор: Осипова, Светлана Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 269 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика белков пшеницы

Классификация белков эндосперма пшеницы

Полимерные белки:

1.1.1. Высокомолекулярные субъединицы глютенина (HMW-GS)

1.1.2. Низкомолекулярные субъединицы глютенина (LMW-GS)

1.1.3. Тритицины

1.1.4. Высокомолекулярные альбумины

1.1.5. Образование глютениновых полимеров и взаимосвязь с качеством
клейковины
Мономерные белки:
1.1.6. Глиадины
1.1.7. Альбумины и глобулины
1.1.8. Некоторые аспекты эволюции белков семян злаков
1.1.9. Синтез запасных белков в созревающей зерновке и отложение в запас
1.2. Ферменты, катализирующие фолдинг белков в полости ЭПР
1.2.1. НАДФН протеин дисульфид изомераза
1.2.2. Пептидилпролил цис-транс- изомераза
1.2.3. Связывающий белок ВІР
1.3. Характеристика факторов, определяющих редокс SH/SS баланс в клетках зерновки пшеницы
1.3.1. Низкомолекулярные редокс SH/SS агенты клеток эндосперма пшеницы
1.3.2. Эндогенные оксидоредуктазы, регулирующие редокс SH/SS
баланс в клетках зерновки пшеницы
1.3.3.Система НАДФН/тиоредоксин редуктаза/тиоредоксины
1.3.4. Система НАДФН/глутатион редуктаза/О.ЗН/глутаредоксины
1.3.5. Липоксигеназы
1.3.6. Влияние других редокс ферментов эндосперма пшеницы на хлебопекарные свойства муки
1.4. Генетическое картирование признаков качества пшеницы
1.5. Заключение из обзора литературы, цели и задач работы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Растительный материал
2.2. Получение ферментного экстракта
2.3. Определение активности тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы
2.4. Определение активности тиолоксидазы
2.5. Определение активности липоксигеназы
2.6. Очистка ТПДО из прорастающих зерновок аффинной хроматографией
2.7. Очистка ТПДО из зерна полной спелости
ионообменной хроматографией
Электрофорез белков ферментных экстрактов
2.8. Электрофорез нативных белков в ПААГ
2.9. Электрофорез в ПААГ с ДДС-Na
2.10. Окраска и обесцвечивание гелей
2.11. Окраска гелей нитратом серебра
2.12. Определение молекулярной массы белков
2.13. Капиллярный электрофорез

2.14. Селективное окрашивание глутатионредуктазы
2.15. Селективное окрашивание липоксигеназы
2.16. Определение кинетических характеристик ТПДО и влияния ингибиторов
2.17. Приготовление препаратов белков клейковины
2.18. Определение физических свойств запасных белков методом агрегации в уксусной кислоте
2.19. Определение свободных и белковых SH-групп и
SS-связей в созревающих зерновках
2.20. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы
2.21. Определение показателей хлебопекарного качества
клейковины
2.22. Идентификация геномных регионов, связанных с
активностью ТПДО
2.23. Фракционирование белков семян дикого злака
Melica turczaninowiana
2.24. Статистика
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. ОЗН-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктазная и тиолоксидазная активности в зерновке пшеницы
3.2. Распределение тиолоксидазной и дисульфидредуктазной активностей при ультрацентрифугировании экстракта из созревающих зерновок пшеницы сорта Скала в градиенте плотности сахарозы
3.3. Активность тиолоксидазы, дисульфидредуктазы, содержание белковых 8Б связей и БН групп в развивающихся зерновках пшеницы сорта Скала. Динамика активности дисульфидредуктазы в зерне разнокачественных сортов пшеницы

обнаружена прямая связь между реологическими свойствами клейковины и содержанием нерастворимых полимерных белков (UPP), которое выражается так называемым полимеризационным индексом, отношением UPP к суммарному количеству полимерных белков (Gupta et al., 1993; Jia et al.,
1996). Очень медленно исследователи приближались к пониманию того, что ключевые механизмы, определяющие реологию HMW полимеров — это взаимодействия между полимерными цепями и ответвлениями полипептидной цепи.
Существование взаимосвязи между SS/SH редокс статусом запасных белков и реологическими свойствами клейковины было замечено давно (Крегович, Вакар, 1974; Bloksma, 1975; Lasztity, 1980; Kaczkowski, Meleszko, 1980; Труфанов, 1994; Shewry, Tatham, 1997). Изменения SS/SH редокс статуса белков во время налива и созревания зерновки были прослежены в работе Rhazi et al. (2003). С этой целью доступные SH группы общего белка, экстрагированного из зерновки в период между цветением и зрелостью, были связаны бромобиманами, и затем был сделан ДДС-Иа-ПААГ электрофорез и обращено-фазовая ВЖХ этих белков. Относительное количество доступных SH групп существенно увеличивалось в период клеточного деления и растяжения, с 7 по 31 дня после цветения (ДПЦ). После 31 Д111Д количество SH групп резко падало, к полному созреванию зерна (51 ДПЦ) большинство белков были окислены, т.е. из SH групп образовались SS связи. Наибольшее количество свободных и связанных SH групп, выявленных во время развития зерна, определялось в субъединицах глютенина, несмотря на их полимерное состояние. Это означает, что в период накопления полимерных белков некоторое количество SH групп остается свободными и способными образовывать внутри- и межмолекулярные SS связи. Эти SH группы исчезают во время фазы дегидратации зерна, которая совпадает с отложением UPP. Последовательность событий, описанная Rhazi et al. (2003) хорошо согласуется с моделью образования полимеров зерновки пшеницы под названием “гиперагрегация“ (Hamer and van Vliet, 2000). Эти авторы