Активность гидролитических ферментов и их ингибиторов в тканях картофеля и колорадского жука: методические аспекты

• Автор: Шевченко, Наталья Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
1. Природа и физиолого-биохимическая роль гидролитических ферментов (аналитический обзор литературы)
1.1. Пектолитические ферменты микроорганизмов и растений (структура, свойства и физиологическая роль)

1.2. Целлюлолитические ферменты

1.3.Эстеразы

1.4. Амилолитические ферменты

2. Растительные ингибиторы гидролитических ферментов

2. Материалы и методы

2.1. Объекты исследований

2.2. Материалы и реактивы

2.3. Методы исследований

2.3.1. Определение концентрации белка
2.3.2. Определение липазной активности в экстрактах
2.3.3. Определение активности протеолитических ферментов

2.3.4. Определение активности ингибиторов трипсина по БАЛА
2.4. Математическая обработка результатов
Результаты и обсуждение
3.1. Модификация и разработка методов определения активности

3.1. Модификация и разработка методов определения активности
3.1.1. Определение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и их ингибиторов по гидролизу субстратов в агарозном геле (модификация методов)
3.1.2. Определение активности липаз, амилаз и их ингибиторов методом агарозных гелевых пластин (разработка метода)
3.2. Активность гидролитических ферментов в экстрактах имаго и личинок колорадского жука
3.3. Активность гидролитических ферментов в тканях картофеля различных сортов
3.4. Активность ингибиторов гидролитических ферментов колорадского жука в тканях картофеля
Выводы
Литература

Введение
Синтез белков с антимикробными свойствами является одной из универсальных защитных реакций растений при воздействии на них биотических и абиотических факторов (Clarini, 2002; Сотченков, Голденкова, 2003). К таким молекулам относятся и ингибиторы, способные нейтрализовать гидролитические (пищеварительные) ферменты патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Наиболее подробные сведения получены о защитной роли растительных ингибиторов, действующих на протеолитические ферменты. Показано, что выделенные из семян бобовых, злаковых растений, клубней картофеля препараты ингибировали действие ферментов микроорганизмов, и вследствие этого, были способны подавлять рост и развитие колоний патогенных грибов (Мосолов, 1983; Валуева, Мосолов, 2002; 2004; 2006; Конарев, 2002). С. Рианом и его сотрудниками было обнаружено, что поранение тканей личинками колорадского жука приводит к системному повышению активности ингибиторов протеиназ во всех органах растений томатов и картофеля (Green, Ryan, 1972; Ryan, 1981). Ингибиторы протеолитических ферментов выявлены практически у всех исследованных представителей дикорастущих и культурных растений (Валуева, Мосолов, 2006). Широкое распространение ингибиторов протеиназ и их содержание в значительных количествах в тканях растений позволяют говорить о них как об одном из важных звеньев в регуляции физиологических и патологических процессов. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что в растительных тканях должны функционировать и ингибиторы других гидролаз: амилаз, пектиназ, целлюлаз, эстераз. Однако, экспериментальные сведения об этих гидролитических ферментах и их ингибиторах при взаимодействии растений с фитопатогенами в научной литературе пока весьма ограничены (Фомичева, 1992; Яруллина, Ибрагимов, 2006). По-видимому, функционирование в

наблюдалось у томатов, инфицированных P.infestans. (Woloshuk, Meulenhoff, et al.). Было также показано, что при инфицировании клубней картофеля этим оомицетом накапливаются белки-ингибиторы сериновых протеиназ с молекулярными массами от 20 до 25 кДа (Нурминская, Богданов, 1990).
В настоящее время показано, что некоторые ингибиторы сериновых протеиназ, выделенные из семян растений и клубней картофеля, способны подавлять рост и развитие патогенных грибов (Cordero, Raventos, Segundo,1992) Например, ингибитор трипсина из кукурузы (Zea mays L.) полностью подавлял рост мицелия гриба Aspergillus flavus. Рекомбинантный белок PKPI-B10, полученный в результате экспрессии кодирующего его гена PKPI-BI0 и действующий как специфический ингибитор трипсина, угнетал рост мицелия гриба F. culmorum. Ингибитор трипсина из семян бобового растения (Psoralea corylifolia L.) эффективно тормозил рост мицелия четырех грибных патогенов -Alternari brassicaceae, A.niger, F.oxysporum и Rhizoctonia cerealis (Ревина, Герасимова, Кладницкая,2008).
В регуляции взаимоотношений растения и фитопатогена очень важно наличие или появление в тканях растений веществ, модифицирующих активность пектолитических ферментов, главным образом ингибиторов, веществ, стабилизирующих клеточные стенки (суберина и лигнина), или полифенольных соединений, а также фитоалексинов, локализованных в клеточных стенках. Ингибирующее действие этих соединений на пектолитические ферменты часто усиливается при активировании пероксидазы и полифенолоксидазы.
В тканях ряда растений были обнаружены вещества, способные в значительной степени инактивировать процессы ферментативного гидролиза пектинов - ингибиторы пектиназ (Рубин, 1977) Эти вещества обнаружены в различных органах растений: в листьях, плодах, клубнях, стеблях и т.д. (Тютерев, 1976).