Влияние дефицита и избытка железа на активность антиоксидантных ферментов и образование ферритина у растений хрустальной травки

• Автор: Ешинимаева, Бэлигма Цыденжаповна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Роль железа в жизнедеятельности растений
1.2 Содержание и формы Fe в почвах и механизмы поступления в растения
1.3. Возможные последствия излишнего накопления Fe в растениях и механизмы поддержания его гомеостаза
1.4. Ферритин: ультраструктурные особенности и функции в живых организмах
1.4.1. Ферритины прокариот
1.4.2. Ферритины животных
1.4.3. Ферритины растений
1.4.3.1. Особенности строения ферритина у растений по данным молекулярных исследований
1.4.3.2. Биосинтез ферритина у растений
1.4.3.3. Компартментация ферритина в клетках и тканях растений и регуляция образования ферритина по данным электронной микроскопии
1.4.3.4. Молекулярные механизмы регуляции биосинтеза ферритина
1.4.3.5. Влияние избытка и дефицита железа на биосинтез ферритина
1.4.3.6. Исследование биосинтеза и деградации ферритина в связи с развитием окислительного стресса
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объект и условия выращивания растений в водной культуре
2.2. Методы биохимических анализов
2.2.1. Определение содержания МДА
2.2.2. Определение содержания перекиси водорода
2.2.3. Определение активности СОД
2.2.4. Определение активности пероксидазы
2.2.5. Определение активности каталазы
2.2.6. Определение содержания пролина
2.2.7. Определение содержания белка в ферментных препаратах
2.2.8. Приготовление проб для определения содержания общего железа
2.2.9. Содержание хлорофилла (а + Ь)
2.2.10. Фиксация проб для электронно-микроскопических исследований52
2.2.11. Проведение молекулярных анализов
2.2.11.1. Выделение тотальной РНК фенол-хлороформным методом
2.2.11.2. Очистка тотальной РНК от примесей ДНК
2.2.11.3. Обратная транскрипция
2.2.11.4. Подбор праймеров для проведения обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.2.11.5. Условия проведения ПЦР-анализа

2.2.11.6. Подготовка проб для секвенирования нуклеотидных последовательностей генов ферритина
2.2.12. Проведение Вестерн-блоттинга для иммунодетекции ферритина
2.2.12.1. Экстракция белков из тканей растения
2.2.12.2. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле
2.2.13. Математическая обработка данных
ГЛАВА 3. РАЗВИТИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И ОБРАЗОВАНИЕ ОТЛОЖЕНИЙ ФЕРРИТИНА В ЛИСТЬЯХ ХРУСТАЛЬНОЙ ТРАВКИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЗАСОЛЕНИЯ И РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ЖЕЛЕЗА
3.1. Ответная реакция молодых растений на изменение содержания
Бе3+ в питательной среде
3.2. Ответная реакция взрослых растений на изменение содержания Ее3+ в среде выращивания в контрольных условиях и при засолении ИаС1
3.3. Дозовая зависимость изменения в листьях содержания железа и состояния окислительного стресса в пресных условиях и в присутствии ИаС1
3.4. Влияние дефицита и “избытка“ Ее3+ на состояние мембран, запасные включения и образование ферритина в пластидах в присутствии и в отсутствии в среде №С1
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА НА ЭКСПРЕССИЮ
ГЕНОВ И СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА ФЕРРИТИНА
4.1 Идентификация генов ферритина, экспрессирующихся в листьях МезетЬпапЛетит crystallinum Ь
4.2. Состояние экспрессии генов в листьях при дефиците железа и его избытке
4.3. Влияние про-оксиданта параквата на экспрессию генов ферритина
4.4. Влияние обработки листьев спермидином на экспрессию генов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Нарушение физиологических процессов у растений в условиях действия абиотических стрессов в значительной степени связано с повышенной генерацией активных форм кислорода (АФК). Неблагоприятные последствия развития окислительного стресса в данной работе рассматриваются в связи с нарушением в клетках гомеостаза Ее. В этих условиях в клетках может накапливаться в свободной форме каталитически активное двухвалентное Ее, которое в присутствии перекиси водорода может образовать самую токсичную форму АФК гидроксил радикал (ОН0). Нарушение гомеостаза Ее можно ожидать у растений, накапливающих в клетках избыточное количество этого металла или при его дефиците, а также в условиях активации окислительных реакций при действии абиотических факторов.
В настоящее время функциональная связь между нарушением гомеостаза Ее и окислительным стрессом рассматривается как новое направление при изучении биосинтеза и защитной роли Ее-содержащего белка ферритина (Впа1 е( а1., 2009). Настоящая диссертация посвящена исследованию состояния окислительного стресса при избытке и дефиците железа на фоне засоления и в контрольных условиях, а также влиянию этих факторов на ультраструктурные особенности ферритина и его содержание.
Актуальность проблемы. Ее — эссенциальный элемент для растений. Ее необходимо растениям для функционирования фотосинтеза и дыхания, в которых в качестве переносчиков электронов участвуют железосодержащие и железосерные белки такие как ферредоксин, цитохромы и другие. Как кофактор Ее входит в состав многих антиоксидантных ферментов (Ее-супероксиддисмутаза, пероксидазы, каталаза) и участвует в образовании предшественника хлорофилла.
Однако, ярко выраженная способность этого металла в восстановленной форме (Ее2 ) вступать в реакции с кислородом с образованием гидроксил радикала (ОН°) - самого токсичного из всех форм АФК, создает необходидистиллированной воды. Стакан с навеской трехкратно доводили до кипения и охлаждали. Образовавшуюся вытяжку фильтровывали в мерные пробирки. Полученный экстракт доводили до нужного объема (6-7 мл) и в дальнейшем использовали для анализа. Пробирки с 1 мл экстракта, 1 мл ледяной уксусной кислоты, 1 мл нингидринового реактива (1,25 г нингидрина, 20 мл 6М Н3РО4, 30 мл ледяной уксусной кислоты) инкубировали в течение 1 часа на кипящей водяной бане. В контрольный образец вместо экстракта добавляли 1 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность полученных окрашенных растворов измеряли на спектрофотометре (Genesis — 10 UV («Thermo Electron Corporation», США)) против контроля при длине волны 520 нм. Содержание пролина рассчитывали с использованием калибровочной кривой по формуле: С = E*k*V/(m* 1 ООО), где
С — концентрация пролина, мкмоль/ г сыр.массы Е — оптическая плотность
к — коэффициент, рассчитанный по калибровочной кривой, 217,49 V — объем, до которого доводится экстракт, мл m - масса навески, г
2.2.7. Определение содержания белка в ферментных препаратах
Определение содержания белка проводили по методу Esen (Esen, 1978). Для определения содержания белка ферментные препараты объемом 5мкл наносили на листы хроматографического ватмана на расстоянии 1 см друг от друга в двукратной повторности. После высушивания листы ватмана окрашивались раствором 0,1% Кумасси R-250 в 10% уксусной кислоте и 25% пропаноле в течение ЗОмин при плавном покачивании на шейкере. Не связавшийся с белком краситель удаляли с бумаги многократным промыванием в дистиллированной воде. Промытый до светло-голубой окраски лист ватмана высушивали и пробочным сверлом вырезали окрашенные области. Высечки заливли 5% раствором SDS и элюировали при встряхивании в течение часа. Оптическая плотность полученных окрашенных растворов измерялась