Разработка и изучение рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита

• Автор: Байков, Иван Константинович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 157 с. : ил.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональная организация природных антител

1.2. Рекомбинантные антитела

1.2.1. Химерные антитела

1.2.2. Гуманизированные антитела

1.2.3. Полноразмерные антитела человека

1.2.4. Мини- и нано-антитела

1.2.5. Изотипы, используемые для создания терапевтических антител

1.3. Получение рекомбинантных антител

1.3.1. Этапы процесса разработки и производства полноразмерных рекомбинантных антител

1.3.2. Очистка рекомбинантных антител

1.4. Вирус клещевого энцефалита как мишень для иммунотерапии
1.4.1. Таксономия рода Flavivirus
1.4.2. Строение вириона ВКЭ
1.4.3. Строение поверхностного гликопротеина Е ВКЭ
1.4.4. Жизненный цикл ВКЭ
1.4.5. Моноклональные антитела против ВКЭ и других флавивирусов
1.4.6. Исследование механизмов нейтрализации флавивирусов антителами
1.4.7. Способы профилактики и лечения вирусного клещевого энцефалита
1.4.8. Разработка терапевтических антител против ВКЭ и других флавивирусов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы и материалы
2.1.1. Список реактивов
2.1.2. Антигены
2.1.3. Растворы
2.1.4. Культуральные среды
2.1.5. Плазмидные ДНК
2.1.6. Бактерии
2.1.7. Клеточные линии
2.1.8. Олигонуклеотиды
2.2. Методы
2.2.1. Исследование протективных свойств препаратов моноклональных и рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита
2.2.2. Выделение суммарной РНК из гибридомных клеток
2.2.3. ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
2.2.4. ПЦР

2.2.5. Амплификация участков ДНК, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов
2.2.6. Встраивание VH- и Д-фрагментов плазмиду pUC19
2.2.7. Лигирование ДНК
2.2.8. Ферментативный гидролиз ДНК
2.2.9. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК
2.2.10. Выделение плазмидной ДНК
2.2.11. Определение концентрации нуклеиновых кислот
2.2.12. Электрофоретическое фракционирование ДНК
2.2.13. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК
2.2.14. Конструирование векторных плазмид рСН2 и pCL2
2.2.15. Встраивание Vir и Уь-фрагментов в векторные плазмиды рСН2 и pCL2
2.2.16. Выделение плазмидной ДНК, не содержащей эндотоксинов
2.2.17. Электрофоретический анализ белков
2.2.18. Масс-спектрометрический анализ антител
2.2.19. Дегликозилирование антител
2.2.20. Трансфекция и культивирование клеток
2.2.21. Хроматографическое выделение рекомбинантных антител
2.2.22. Анализ олигомерных форм антител с использованием высокоэффективной гель-фильтрации
2.2.23. Вестерн-блот анализ
2.2.24. Твердофазный иммуноферментный анализ
2.2.25. Исследование сродства антител к рекомбинантному белку Е с использованием оптического биосенсора ProteOn XPR
2.2.26. Изучение нейтрализующей активности антител in vitro в реакции ингибирования фокусообразования
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Оценка протективной активности мышиных моноклональных антител против ВКЭ in vivo с целыо выбора прототипного антитела
3.2. Получение ДНК-фрагментов, кодирующих вариабельные домены МКА 14D5, 1В1 и 13D6, и определение нуклеотидных последовательностей этих фрагментов
3.3. Электрофоретический и масс-спектрометрический анализ образца МКА 14D5
3.4. Конструирование кассетных плазмидных ДНК для экспрессии полноразмерных рекомбинантных антител с константной частью иммуноглобулинов человека IgGl/Kanna81
3.5. Конструирование плазмидных ДНК для экспрессии химерных антител на основе МКА 14D5
3.6. Наработка и очистка химерных антител chl4D5a и chl4D5b
3.7. Масс-спектрометрический анализ химерных антител chl4D5a и chl4D5b. Проверка наличия гликозилирования у полученных антител
3.8. Определение иммунохимических свойств антител chl4D5a и chl4D5b
3.9. Нейтрализация инфекционности ВКЭ антителом chl4D5a и МКА 14D5 in vitro
3.10. Протективная активность антитела chl4D5a против ВКЭ in vivo
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ

В ходе первой фазы клинических испытаний антитела Ни-Е1б, кодовое название MGAWN1, было установлено, что дозы вплоть до 30 мг/кг были успешно перенесены с незначительным числом мягких побочных эффектов (Beigel J. H. et al., 2010; Sautto G. et al., 2013; Lim S. P. et al., 2013). В 2009 г компания MacroGenisc, Inc. начала вторую фазу клинических испытаний этого антитела (

Полноразмерные человеческие антитела CR4374, CR4353, CR4354 и CR4348 против вируса Западного Нила также рассматриваются как потенциально терапевтические (Throsby М. et al., 2006; Marasco W. A. et al., 2007; Vogt M. R. et al., 2009). Антитела CR4374 и CR4353 обеспечивали 50% уровень протекции в дозировке около 13 мкг/кг и 360 мкг/кг, соответственно, при введении за 24 ч до инфекции мышам, инфицированным 20 ЛД50 вируса Западного Нила. При этом аффинность антител к инактивированному вирусу составила около 56 нМ и 6 нМ, соответственно (Throsby М. et al., 2006). Антитела CR4348 и CR4354 обеспечивали 100% уровень протекции в дозировке около 1,4 мкг/мышь и 0,4 мкг/мышь, соответственно, при введении за 24 ч до инфекции мышам, инфицированным вирусом Западного Нила (Vogt М. R. et al., 2009).
Наличие протективных свойств также установлено для одноцепочечных антител против вируса Западного Нила, а также их конъюгатов с Fc-фрагментом антител (Gould L. H. et al., 2005). Протективные и терапевтические свойства также показаны для аденовирусного вектора, доставляющего ген конъюгата одноцепочечного антитела с Fc-фрагментом человеческого антитела (Pereboev A. et al., 2008).
Против вируса лихорадки Денге разрабатывается несколько потенциально терапевтических антител. Для мышиного моноклонального антитела Е60, которое получено против вируса Западного Нила и направлено на эпитоп в области петли слияния гликопротеина Е, а также связывается с гликопротеином Е серотипа 2 вируса