Кинетический механизм узнавания и превращения АР-сайтов в ДНК АР-эндонуклеазой 1 человека в процессе эксцизионной репарации оснований

• Автор: Канажевская, Любовь Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 173 с. : ил.

Содержание
Список сокращений
Введение
1. Структурные и кинетические особенности АРЕ1 человека в процессе эксцизионной репарации оснований (Обзор литературы)
1.1. АР-сайты в ДНК и эксцизионная репарация оснований
1.2. Особенности структуры и функций апуриновых/апиримидиновых эндонуклеаз семейства ЕхоШ и ЕпсЫУ
1.2.1. АР-эндонуклеазы прокариот ХЙ1 (ЕхоШ) и N£0 (ЕпбоГУ)
1.2.2. АР-эндонуклеазы сахаромицетов Арп1 и Арп
1.2.3. Эндонуклеаза 11гр1 из БгозорЬИа те1ажща51ег
1.2.4. АРКИ и ЕХО-3 из С. е^ат
1.2.5. Основная эндонуклеаза млекопитающих АРЕ
1.2.5.1. Репарационная активность АРЕ
1.2.5.2. Участие АРЕ1 в инцизионной репарации нуклеотидов
1.2.5.3. Регуляторная функция АРЕ
1.2.5.4. Биологическая роль АРЕ
1.2.6. Запасная эндонуклеаза млекопитающих АРЕ
1.3. Структурные детерминанты АР-эндонуклеазной активности АРЕ
1.3.1. Поиск и специфическое узнавание АР-сайтов в ДНК
1.3.2. Строение активного центра АРЕ
1.3.3. Координация иона Мр2+ и его роль в катализе
1.3.4. Механизм каталитической реакции АРЕ
1.3.5. Кинетические параметры АР-эндонуклеазной реакции, катализируемой АРЕ
1.4. Заключение к обзору
2. Материалы и методы
2.1. Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов
2.2. Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих
природный АР-сайт
2.3. Субстраты для изучения АР-эндонуклеазной активности фермента АРЕ
2.4. Введение метки [32Р] по 5'-концу олигодезоксирибонуклеотидов
2.5. Сайт-направленный мутагенез остатка Азп-212 АРЕ
2.6. Наработка и очистка рекомбинантных белков
2.7. Проверка АР-эндонуклеазной активности фермента
2.8. Регистрация накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых ДНК-субстратов ферментом АРЕ1 методом гель-электрофореза
2.9. Определение величин констант Ку и кса1 для УТ АРЕ1 и У171Р-Р173Ь-1Т174К АРЕ1 в стационарных условиях

2.10. Регистрация предстационарной кинетики взаимодействия АРЕ1 с ДНК методом «остановленной струи»
2.11. Количественная обработка данных предстационарной кинетики. Определение кинетического механизма и констант скорости элементарных стадий процесса
2.12. Определение значений констант Км и кса[ для WT АРЕ1 по теории графов
2.13. Регистрация кинетики взаимодействия мутантных форм N2120 и N212А с 2-аРи-содержащими субстратами
2.14. Изучение стабильности комплексов АРЕ1 с продуктами превращения специфических субстратов
3. Изучение кинетического механизма узнавания и превращения поврежденной ДНК АР-эндонуклеазон 1 человека (Результаты)
3.1. Конформационная динамика и кинетика процесса удаления АР-сайтов из ДНК ферментом АРЕ1 в условиях ВЕК
3.1.1. Изменение собственной флуоресценции АРЕ 1 при связывании с ДИК
3.1.2. Регистрация конформационных переходов в молекуле АТ АРЕ1 при взаимодействии с природным АР-сайтом, Е-аналогом и в-лигандом
3.1.3. Определение минимального кинетического механизма и количественных параметров взаимодействия фермента АРЕ1 с АР-, Р-субстратом и О-лигандом
3.1.4. Анализ накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых АР- и Р-субстратов ферментом АРЕ1 методом гель-электрофореза
3.2. Конформационная динамика ДНК-субстратов в ходе взаимодействия с \,Т АРЕ1.
3.2.1. Регистрация изменений интенсивности флуоресценции остатка 2-аРи, встроенного в ДНК-субстраты и лиганды в ходе их взаимодействия с УТ АРЕ
3.2.2. Определение кинетических параметров, описывающих конформационнуто динамику ДНК-субстратов в процессе их превращения ферментом АРЕ
3.2.3. Анализ накопления продуктов разрезания ферментом АРЕ1 [32Р]-меченых 2-аРи-содержащих субстратов методом гель-электрофореза
3.2.4. Регистрация изменений интенсивности флуоресценции остатков Тгр фермента в ходе взаимодействия с 2-аРи-содержащими субстратами
3.2.5. Кинетические параметры превращения 2-аРи-содержащих субстратов ферментом АРЕ1, регистрируемого по изменению флуоресценции остатков Тгр
3.3. Исследование влияния консервативного остатка Азп-212 на отдельные стадии процесса, катализируемого АРЕ
3.3.1. Регистрация конформационных переходов в активном центре мутантной формы N2120 АРЕ1 в ходе взаимодействия с поврежденной ДНК в предстационарных условиях
3.3.2. Определение минимального кинетического механизма и количественных параметров взаимодействия N2120 АРЕ1 с АР- и Е-содержащей ДНК
3.3.3. Регистрация кинетики разрезания Р(2-аРи)-субстрата белком N2120 АРЕ1 методом стационарной флуориметрии
3.3.4. Анализ накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых АР- и Р-субстратов мутантной формой N2120 АРЕ1 методом гель-электрофореза

3.3.5. Кинетический механизм взаимодействия мутантной формы №12А АРЕ1 со специфическими субстратами: предстационарная кинетика, стационарная флуориметрия, гель-электрофорез и количественный анализ
3.4. Исследование влияния тройной мутации У171Е-Р173Ь-М174К на взаимодействие АРЕ1 с ДНК
3.5. Стационарная кинетика превращения АР-и Б-содержащей ДНК ферментом
АРЕ1, а также его мутантной формой У171Е-Р173Ь-Ш74К АРЕ
4. Обсуждение полученных результатов
4.1. Предстационарная кинетика взаимодействия УТ АРЕ1 с АР- и Е-сайтом
4.2. Конформационная динамика АР- и Р-содержащих ДНК-субстратов в ходе их превращения ферментом АРЕ
4.3. Зависимость скорости превращения 2-аРи-содержащих ДНК-субстратов ферментом АРЕ1 от положения флуоресцирующего основания
4.4. Регистрация процесса заполнения полости, образующейся в ДНК после выворачивания АР-сайта, по флуоресценции фермента и ДНК-субстратов
4.5. Роль консервативного остатка Адп-212 в каталитическом механизме АРЕ1
4.6. Влияние тройной мутации У171Е-Р173Ь-Ш74К на каталитические свойства АРЕ
Заключение
Выводы
Список использованной литера туры

30°-ный изгиб оси спирали, нарушение стэкинга соседних с AP-сайтом оснований, а главное, повышенная гибкость и эластичность участка ДНК на расстоянии 2-3 нуклеотида с 5'- и З'-стороны от повреждения [179]. Установлено, что дезоксирибоза AP-сайта может находиться как внутри, так и снаружи двойной спирали, и это зависит от природы основания, стоящего напротив повреждения в интактной цепи ДНК [180]. В случае, когда напротив AP-сайта стоит пуриновый нуклеотид (AP/Pu), апиримидиновая дезоксирибоза занимает преимущественно внеспиральное положение, в то время как апуриновый сайт напротив пиримидинового нуклеотида (АР/Ру) большую часть времени находится внутри спирали [181]. Внеспиральное положение AP-сайта AP/Pu пары стабилизируется за счет нетипичного сближения пуринового основания, стоящего напротив повреждения, с основанием, расположенным с З'-стороны от AP-сайта в поврежденной цепи так, что между ними образуется водородная связь (Рис. 7). Возникновение необычных водородных связей и стэкинговых взаимодействий в области AP-сайта, по-видимому, обеспечивает стабилизацию его изогнутой конформации.
Интересно, что АРЕ1 также способна образовывать комплекс с ДНК, содержащей однонуклеотидную брешь [182], в структуре которой наблюдается аналогичная деформация [177]. Результаты симуляции структуры комплекса АРЕ1 с ДНК-субстратом методом молекулярной динамики также свидетельствуют о ключевом значении гибкости поврежденной ДНК для специфического связывания ферментом [183]. Таким образом, имеющиеся данные позволяют с высокой долей вероятности предполагать, что подверженность АР-содержащей ДНК структурным флуктуациям и ее способность принимать уникальную изогнутую конформацию являются специфическими маркерами для связывания ферментом АРЕ1.
1.3.2. Строение активного центра АРЕ
Структурные и функциональные особенности АР-эндонуклеаз, рассмотренные в разделе 1.2, свидетельствуют о том, что эти белки прошли серьезный эволюционный отбор, сохранив важные структурные элементы, которые позволяют быстро и эффективно гидролизовать фосфодиэфирную связь. Следствием такой «оптимизации» является
Рис. 7. Фрагмент структуры ДНК дуплекса с АР-сайтом напротив цитозина (С20), полученной методом молекулярной динамики [181]. АР-сайт (АР) и соседние основания выделены цветом. Сближенное положение оснований С20 и А8 приводит к возникновению между ними атипичной водородной связи.