Молекулярное узнавание, аффинность и термодинамика белок-белковых взаимодействий в цитохром P450-зависимых монооксигеназных системах

• Автор: Яблоков, Евгений Олегович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 169 с. : ил.

Оглавление

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ
Цитохромы Р

Актуальность проблемы

Цель работы
Задачи

Научная новизна работы

Научно-практическая значимость работы

Апробация диссертационной работы

Личный вклад автора
Публикации
Структура работы
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Роль ферментной системы цитохрома Р
1.2 Открытие разнообразия фементных систем цитохрома Р
1.3 Микросомальная ферментная система цитохрома Р
1.3.1 Общая характеристика микросомальной монооксигеназной Р450-зависимой системы
1.3.2 Структура и свойства цитохром Р450 редуктазы
1.3.3 Роль межмолекулярных взаимодействий CYP-CPR в функционировании микросомальной монооксигеназной системы
1.3.4 Структура и функции микросомального цитохрома Ь
1.3.5 Митохондриальная изоформа цитохрома Ь
1.3.6 Значение межмолекулярных взаимодействий между CYP и CYB5
1.4 Митохондриальная ферментая система цитохрома Р
1.4.1 Характеристика митохондриальной монооксигеназной системы
1.4.2 Структура и функция адренодоксина
1.4.3 Взаимодействие адренодоксина с микросомальными Р
1.5 Бактериальная ферментная система цитохрома Р
1.5.1 История изучения бактериальных цитохромов Р
1.5.2 Функции бактериальных цитохромов Р
1.6 Эволюция и разнообразие ферментных систем цитохрома Р
1.7 Метод SPR (Surface Plasmon Resonance)
1.7.1 Описание подходов для изучения белок-белковых комплексов
1.7.2 Описание явления SPR
1.7.3 Описание принципа детекции межмолекулярных взаимодействий оптическими биосенсорами на эффекте SPR
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Оборудование
2.2 Материалы
2.3 Регистрация белок-белковых взаимодействий с помощью оптического биосенсора на технологии оптического плазмонного резонанса
' 3 ‘
2.3.1 Подготовка прибора
2.3.2 Подготовка буфера
2.3.3 Подбор иммобилизационного буфера
2.3.4 Иммобилизация лигандов на чипе СМ-
2.3.5 Подготовка аналита
2.3.6 Анализ взаимодействий
2.3.7 Обработка данных и анализ кинетики
2.4 Анализ термодинамических параметров взаимодействия цитохромов Р450 и иммобилизированных белков-партнёров
2.5 Методы статистической обработки
2.5.1 Определение доверительного интервала для получаемых параметров взаимодействия
2.5.2 Фитинг
2.5.3 Алгоритм Левенберга-Марквардта
2.5.4 Оценка качества фитирования
2.5.5 Достоверность данных
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1 Подбор иммобилизационного буфера
3.2 Подбор экспериментальных условий и анализ взаимодействий
3.3 Аффинность и селективность взаимодействия СУР с СУВ5 (А и В) крысы и человека
3.4 Определение термодинамических параметров образования белок-белковых комплексов СУР с СУВ5 (А и В) крысы и человека
3.5 Аффинность и селективность взаимодействия СУР с СР1Г крысы и Ас!Х человека
3.6 Определение термодинамических параметров белок-белковых комплексов СУР с СРЛ крысы и АбХ человека
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Благодарности
Список литературы
Список используемых сокращений
SPR, ПГТР - surface plasmon resonance, поверхностный плазмонный резонанс.
RU - resonance unit, резонансная единица.
EDC - К-этил-14'-(3-ДИметиламинопропил)-карбодиимид.
NHS - N-гидроксисукцинимид.
SDS - додецилсульфат натрия.
ЭПР - эндоплазматический ретикулюм.
NADPH, НАДФ*Н-восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфата.
FAD, ФАД - флавинадениндинуклеотид
FMN, ФМР1 - флавинмононуклеотид
CYP - цитохром Р
CPRrat — цитохром Р450 редуктаза крысы
AdXhum - адренодоксин человека
CYB5Arat - цитохром В5 тип А микросомальный крысы
CYB5Brat - цитохром В5 тип В внешней мембраны митохондрий крысы
CYB5Ahum - цитохром В5 тип А микросомальный крысы
CYB5Bhum - цитохром В5 тип В внешней мембраны митохондрий человека

Typhimurium цитохрома Ь5 дает пятикратный рост уровня метаболизма диметилнитрозамина цитохромом Р450 2Е1 [99], но перенос электрона имеет важное значение для этой стимуляции [116, 114]. Этот крайне ограниченный объем информации, полученных при изучении рекомбинантных экспрессионных систем, поддерживает представления о роли Ь5 in vivo, особенно для цитохромов Р450 ЗА4 и 2Е1. Но для других Р450, отмеченых выше, физиологическая роль цитохрома Ь5 остается неизвестной, требуется использование Ь5-нокаутных животных или клеточных линий. Кроме того, вопрос вкладе конформационной стимуляции и переноса электрона, вероятно, потребует создание гем-дефицитных мутантных форм цитохрома Ь5.
В отличие от метаболизирующих лекарства цитохромов Р450, о которых сказано выше, есть весомые доказательства того, что аллостерическое влияние цитохрома Ь5 играет важную роль в регуляции активности Р450 17А1. Этот цитохром Р450 последовательно гидроксилирует прегненолон (или прогестерон), переводя стероид в соответствующие 17а-гидрокси производное. Далее за этой реакцией следует второе гидроксилирование, ведущие к расщеплению углерод-углеродной связи (17,20-лиазная реакция) и формированию дегидроэпиандростерона (DHEA) или андростендиона, соответственно. В 17а-гидроксипроизводные являются предшественниками глюкокортикоидов, в то время как продукты 17,20 лиазной реакции служат прекурсорами половых стероидов. Таким образом цитохром Р450 17А1 является узловым ферментом стероидогенеза, задающим направление синтеза прекурсоров стероиднх гормона. Без обработки цитохромом 17А1 прогестерон и прегненолон идут на образование минералкортикоидов, после реакции 17а-гидроксилирования метаболиты приводят к глюкокортикоидам, а после серии двух реакций гидроксилирования образуются предшественники половых гормонов.
Было предположено, что цитохром Ь5 вносит свой вклад в дифференциальную регуляцию этих двух путей, модулируя активность цитохрома Р450 17А1 в репродуктивных тканях. Уровнь экспрессии цитохрома Ь5 высок в