Антимикробные белки и пептиды как эндогенные иммуномодуляторы при экспериментальном стрессе

• Автор: Янкелевич, Ирина Алексеевна
• Шифр специальности: 14.03.03, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2Л. Морфо-функциональная характеристика нейтрофильных

гранулоцитов

2.2. Характеристика белков и пептидов нейтрофильных гранулоцитов

2.2.1. Лактоферрин

2.2.2. Антимикробные пептиды. Структура. Классификация.

Механизмы действия

2.2.2.1. Дефенсины нейтрофильных гранулоцитов крыс

2.3. Антимикробные белки и пептиды в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета
2.4. Физиология стресса
2.5. Стресс и иммунная система
2.5.1. Стресс и система крови
3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Экспериментальные животные и модель исследования
3.2. Получение биологического материала
3.2.1. Получение экссудата
3.3. Выделение дефенсинов из нейтрофилов экссудата крыс
3.3.1. Экстракция катионных пептидов из лейкоцитарных клеток
3.3.2. Ультрафильтрация
3.3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография
3.3.4. Удаление примеси липополисахарида
3.4. Электрофоретические методы
3.4.1 Электрофорез в кислой буферной системе
3.5. Иммунохимические методы исследования
3.5.1. Получение антисывороток к дефенсинам
3.5.1.1. Конъюгация дефенсинов крысы с овальбумином

3.5.1.2. Иммунизация кроликов конъюгатом дефенсинов с
овальбумином
3.5.2. Выделение антител к дефенсинам крысы из антисывороток
3.5.2.1. Связывание дефенсинов крысы с цианоген бромид-активированной агарозной матрицей
3.5.2.2. Выделение из антисыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания
3.5.2.3. Выделение антител к дефенсинам крысы из фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом аффинной хромотографии
3.5.3. Конъюгация антител с пероксидазой хрена
3.5.4. Иммуноцитохимический метод анализа сыворотки на наличие специфических антител
3.5.5. Процедура иммуноферментного анализа по определению концентрации ГШИР-З в плазме крови экспериментальных крыс
3.5.6. Иммуноферментный анализ по определению концентрации кортикостерона
3.6. Цитологические методы исследования
3.6.1. Подсчет лейкоцитарной формулы крови
3.6.2. Подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева
3.7. Определение примеси ЛПС в пробах
3.8. Метод полимеразой цепной реакции
3.8.1. Выделение матричной РНК из спленоцитов крыс
3.8.2. Получение к ДНК из мРНК
3.8.3. Проведение полимеразной цепной реакции
3.9. Статистическая обработка результатов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Выделение дефенсинов крыс из нейтрофильных гранулоцитов
4.1.1. Экстракция катионных белков и пептидов из лейкоцитов крысы

и их фракционирование методом ультрафильтрации
4.1.2. Очистка и разделение дефенсинов методом обращенно-фазовой
высокоэффективной жидкостной хроматографии
4.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения концентрации КаЙЛР-З в биологических жидкостях крыс
4.3. Иммуномодулирующие свойства антимикробных белков и
пептидов нейтрофильных гранулоцитов
4.3.1. Динамика изменений концентрации кортикостерона, распределения лейкоцитов в крови и дегрануляции нейтрофильных гранулоцитов у крыс при экспериментальном стрессе
4.3.2. Динамика изменений экспрессии генов цитокинов и ТЫМ в селезенке крыс при экспериментальном стрессе
4.3.3. Влияние введения лактоферрина человека и дефенсина крысы КщЫР-З на лейкоцитарный состав крови, продукцию кортикостерона, экспрессию генов цитокинов и ТЫМ крысы в отсутствии стрессирующего воздействия
4.3.4. Влияние введения лактоферрина человека на развитие стресс-реакции в условиях экспериментального стресса
4.3.5. Влияние введения лактоферрина и ЛПС на стресс-индуцированные изменения в экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов и ТЪК
4.3.6. Влияние введения дефенсина крыс БШМР-З на течение экспериментального стресса
4.3.7. Влияние введения антител к суммарной фракции дефенсинов
крыс на течение экспериментального стресса
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

можно рассматривать в качестве одной из составляющих противовоспалительного действия лактоферринов.
Ионы железа необходимы в качестве катализаторов генерации активных форм кислорода. Поэтому лактоферрин, связывая Ре3+, может уменьшить продукцию активных форм кислорода лейкоцитами в очагах воспаления [234]. Существуют противоречивые мнения относительно влияния лактоферрина на пролиферацию лимфоцитов. Так Эседжи с соавторами [29] сообщают о его стимулирующем действии на этот процесс, тогда как Эшорн [43] и Ричи [113] установили противоположный эффект. На клеточном уровне ЛФ увеличивает число натуральных киллеров (ЫК) [144], повышает мобилизацию нейтрофилов в кровь [187], индуцирует фагоцитоз [220] и может модулировать миелопоэз [63].
Поскольку молекула ЛФ положительно заряжена, она способна связываться с отрицательно заряженными соединениями на поверхности различных клеток иммунной системы [47]. Можно предположить, что такое взаимодействие может инициировать сигнальные пути, приводящие к различного рода клеточным реакциям, таким как активация, дифференцировка и пролиферация. Также было показано, что ЛФ транспортируется в ядро, где он может связываться с ДНК и активировать экспрессию отдельных групп генов [50; 219].
АМП влияют на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты, дендритные клетки) и эпителиальные клетки, определяя отдельные стороны взаимодействия врожденной и адаптивной иммунной систем. Для млекопитающих была показана роль АМП в реализации таких клеточных функций, как хемотаксис, апоптоз, транскрипция генов и продукция цитокинов [200]. Кроме того, существуют данные, свидетельствующие о том, что пептиды подавляют индуцированную бактериями продукцию цитокинов, стимулируют заживление ран и ангиогенез [1; 28].