Mn-пероксидазы эндофитного и эпифитного штаммов бактерии Azospirillum brasilense

• Автор: Купряшина, Мария Александровна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 127 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Растительно-микробные взаимоотношения в ризосфере и современные представления о систематике и физиологии ассоциативных бактерий

рода АгозртИит

1.2 Общая характеристика фенолоксидаз

1.3 Фенолоксидазная активность бактерии рода АгояртИит

1.4 Биологический синтез золотых наночастиц микроорганизмами

Глава 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Микроорганизмы и условия их культивирования

2.2 Материалы и методы исследования
2.2.1 Определение активности внеклеточной Мп-пероксидазы
2.2.2 Оценка активности Мп-пероксидазы при выращивании
бактерий на среде содержащей соединения ароматической природы
2.2.3 Определение концентрации белка
2.2.4 Определение активности Мп-пероксидазы при инокуляции
корней проростков пшеницы азоспириллами
2.2.4.1 Инокуляция проростков пшеницы бактериями
2.2.4.2 Качественное обнаружение Мп-пероксидазной активности на корнях
2.2.5 Выделение и очистка фермента
2.2.6 Электрофоретический анализ ферментов
2.2.7 Степень чистоты полученных препаратов
2.2.8 Определение рН-оптимумов выделенных ферментов
2.2.9 Установление температурного оптимума
2.2.10 Определение времени полуинактивации ферментов
2.2.11 Ингибирование этилендиаминтетраацетатом

2.2.12 Субстратная специфичность
2.2.13 Определение лигнинолитической активности азоспирилл
2.2.14 Определение лигниндеградирующей функции Мп-пероксидазы
2.2.15 Установление чувствительности азоспирилл к присутствию в среде золотохлористоводородной кислоты
2.2.16 Методы обнаружения и изучения частиц восстановленного золота
2.2.16.1 Просвечивающая электронная микроскопия
2.2.16.2 Ультрафиолетовая спектроскопия
2.2.16.3 Рентгеновская флуоресценция
2.2.16.4 Динамическое светорассеяние (фотонная корреляционная спектроскопия)
2.2.17 Статистическая обработка результатов
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Обнаружение активности внеклеточной Мп-пероксидазы
3.2 Зависимость продукции Мп-пероксидазы А. Ьгаз Пете Бр245 и 8р7 от
условий культивирования
3.3 Влияние фенольных соединений на Мп-пероксидазную активность
3.4 Активность Мп-пероксидазы А. ЬгаяПете при инокуляции корней
пшеницы
3.5 Выделение и очистка Мп-пероксидазы А. ЬгаяИете
3.6 Характеристика полученных препаратов МпПзР245 и МпПзр
3.7 Лигнинолитическая активность А. ЬгаяИете Бр245 и Бр7 и участие
Мп-пероксидазы в процессах окисления модельных соединений лигнина
3.8 Восстановление золота из хлораурата бактериями АгозртИит brasilen.se и
возможная роль Мп-пероксидазы в данном процессе
3.8.1 Влияние золотосодержащего соединения НАиС14 на рост
азоспирилл

3.8.2 Биосинтез золотых наночастиц бактериями А. ЬгаяИете.
3.8.3 Образование золотых наночастиц в присутствии препаратов Мп-пероксидаз А. Ьгавйете Бр245 и Бр
3.8.4 Предполагаемый механизм биовосстановления золота Мп-пероксидазами А. ЬгаяНете
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2Л Микроорганизмы и условия их культивирования
В качестве объекта исследования в работе были использованы два штамма A. brasilense Sp7 (эпифитный) и Sp245 (эндофитный) из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН. Культивирование бактерий проводили при 30°С на жидкой и агаризованной (2%) малатно-солевой среде следующего состава (г/л): КН2Р04 - 0,1; К2НР04 - 0,4; NaCl - 0,1; Na2Mo04x7H20 - 0,002, MgS04x7H20 - 0,2; FeS04x7H20 - 0,02; яблочная кислота - 5,0; NaOH - 1,7; NH4C1 - 1,0; СаС12 - 0,02; pH 6,8 (Dobereiner et al., 1976). Посевным материалом служила 12-ти часовая культура, выращенная на аналогичной среде. Контроль чистоты культуры осуществляли методом раздавленной капли (Нетрусов и др., 2005) на микроскопе Jenaval (Carl Zeiss, Германия).
2.2 Материалы и методы исследования
2.2.1 Определение активности внеклеточной Мп—пероксидазы
Активность МпП азоспирилл определяли спектрофотометрически на приборе СФ-46 (Ломо, СССР):
- по скорости окисления 2,6-диметоксифенола (Acros Organics, США, 8=30,5 mJVr'crrf') при 30°С (Paszczynski et al., 1988). Реакционная смесь объемом 2 мл содержала: 50 мМ Na-тартратный буфер, pH 4,5, 1 мМ 2,6-диметоксифенол, 1 мМ MnS04x5H20, образец. Реакцию начинали добавлением 0.1 мМ Н202;
- по скорости окисления АБТС (Sigma, США, s=36 miVT'crrf'). Состав реакционной смеси: 50 мМ Na-тартратный буфер, pH 4,5, 5 мМ АБТС, 1 мМ MnS04x5H20, образец. Реакцию начинали добавлением 0,1 мМ Н202 (Леонтьевский и др., 1990);