Повышение регенеративного потенциала имплантационного материала на основе костного коллагена и рекомбинантного белка человека rhBMP-2

• Автор: Громов, Александр Викторович
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 168 с. : ил.

Оглавление
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Костная ткань

1.1. Состав костной ткани

1.1.1. Межклеточный матрикс

1.1.2. Клетки костной ткани

1.2. Классификация костных тканей

1.3. Кость как орган
1.3.1. Компактное вещество
1.3.2. Губчатое вещество
1.3.3. Надкостница
1.3.4. Эндост
1.4. Развитие, рост и регенерация костной ткани
1.4.1. Развитие костной ткани
1.4.2. Физиологическая регенерация
1.4.3. Репаративная регенерация
1.5. Кость как объект трансплантации и тканевой инженерии
2. ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
2.1. Аутогенные материалы
2.2. Аллогенные материалы
2.3. Ксеногенные материалы
2.4. Деминерализованный костный матрикс
2.5. Минеральный матрикс
2.6. Синтетические материалы
2.7. Костные морфогенетические белки как компоненты остеопластических материалов
2.7.1. Получение ВМР
2.7.2. Носители ВМР
2.7.3. Коммерчески доступные препараты с ВМР
2.8. Заключение по разделу
Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3. Материалы, реактивы и оборудование
3.1. Клеточные линии
3.2. Лабораторные животные
3.3. Питательные среды
3.4. Имплантационные материалы
3.5. Материалы для иммуноферментного анапиза
3.6. Медицинские препараты
3.7. Другие реактивы
3.8. Оборудование
Методы
4.1. Определение содержания жира в костной ткани
4.2. Двулучевой сканирующий электронный микроскоп
4.3. Определение содержания кальция в костной ткани
4.4. Определение содержания влаги в костной ткани
4.5. Определение pH водной вытяжки костной крошки
4.6. Определение остаточного содержания нативных ВМР-2 и ВМР-7 в костной ткани
4.7. Определение микробиологической обсемененности полученных материалов
4.8. Метод иммуноферментного анализа концентрации рекобгшантного гИВМР-
4.9. Фракционирование белков методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ПААГ-ДСН)
4.10. Определение биологической активности гкВМР-2 на клетках линий С2С12 и СЗН10Т1/
4.11. Метод определения активности щелочной фосфатазы в мышечной ткани крыс
4.12. Метод определения концентрации кальция в образцах мышечной тканей крыс
4.13. Экспериментальная модель эктопического остеогенеза
4.14. Определение количества иммобилизованного наДКМ гЪВМР-
4.15. Экспериментальная модель ортотопического остеогенеза
4.15.1. Хирургические операции
4.15.2. Гистологическое исследование костного материала
4.16. Экспериментальная модель восстановления сегментарного дефекта гребня альвеолярного отростка челюстей собаки
4.16.1. Проведение эксперимента
4.16.2. Гистологическое исследование костного материала
4.17. Экспериментальная модель дефектов бедренных и большеберцовых костей у кроликов
4.17.1. Методика насыщения пористых титановых имплантатов композиционным материалом на основе ДКМ с добавлением гЬВМР-
4.17.2. Методика насыщения пористых титановых имплантатов прилипающей фракцией аутологичных миелокариоцитов
4.17.3. Хирургические операции

4.17.4. Гистологическое исследование костного материала
4.17.5. Определение прочности новообразованной костной ткани
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5. Разработка методики получения ксеногенного деминерализованного костного матрикса
5.1. Фрагментагция кости и грубая очистка
5.2. Обезжиривание
5.3. Первичный размол и деминерализация
5.3.1.Определение оптимального размера костной крошки для полной
деминерализации
5.3.2. Определение оптимальной концентрации кислоты и времени
обработки для полной деминерализации костной крошки
5.4. Отмывка и высушивание
5.5. Вторичный размол и фракционирование
5.6. Лиофилизация и радиационная стершизация
5.7. Остаточное содержание нативных факторов роста кости ВМР-2 и ВМР-7 на различных этапах технологического процесса получения ДКМ
5.8. Технологическая схема получения ДКМ в виде крошки
5.9. Виды исполнения ДКМ
5.10. Преимущества разработанной методики получения ДКМ
6. Получение и определение биологической активности рекомбинантного фактора роста человека rhBMP-2
6.1. Определение биологической активности rhBMP-2 in vitro
6.1.1. Определение концентрации rhBMP-2 с помощью ИФА
6.1.2. Определение биологической активности рекомбинантного rhBMP-
на клетках линий С2С12 и СЗН10Т1/
6.2. Определение биологической активности rhBMP-2 in vivo на модели эктопического остеогенеза
6.2.1. Оптимизация методики определения активности щелочной фосфатазы в мышечной ткани
6.2.2. Оптимизация методики определения количества кальция в мышечной ткани
6.2.3. Определение активности щелочной фосфатазы и кальция в коллагеновых губках, пропитанных rhBMP-2, на модели эктопического остеогенеза
7. Получение композитного остеопластического материала на основе ДКМ с добавлением rhBMP-2 и гиалуроновой кислоты
7.1. Оптимизация условий иммобилизации rhBMP-2 на ДКМ
7.2. Определение соотношения компонентов композиционного препарата
7.3. Токсикологическое исследование материала
7.3.1. Краткое изложение результатов испытаний

2.1. Аутогенные материалы
Аутотрансплантаты готовятся из собственных тканей пациента, следовательно, полностью исключаются основные иммунологические и большинство инфекционных осложнений при последующей пересадке. По своим остеоиндуктивным, остеокондуктивным и остеогенным свойствам аутогенные материалы являются «золотым стандартом» костных материалов [Goldberg, 1991; Klein, 1991; Maus, 2008; Summers, 1989]. После пересадки аутогенного трансплантата на первой неделе происходит процесс адаптации клеток кости, периоста, костного мозга с последующей их реваскуляризацией. Во второй фазе наблюдается стимуляция клеток костного ложа, и они, дифференцируясь в остеобласты, создают костную матрицу. За счет остеоиндуктивной деятельности клеток костного ложа образуется новая кость, где пересаженный аутотрансплантат играет роль костного скелета [Корнилов, Аврунин, 2001]. В дальнейшем одновременно протекает резорбция кости и ее новообразование, что приводит к инкорпорации костного трансплантата в хозяйское ложе.
Аутотрансплантаты берут из гребня подвздошной кости, ребра, малой берцовой кости, а также фрагментов верхней и нижней челюсти — нижнечелюстного симфиза, ретромолярной области и ветви; бугра верхней челюсти, а также гиперостозов кости [Calori, 2011; Schwarz, 1991; Дробышев, 2004; Кулаков, 2007].
Несмотря на очевидные преимущества аутотрансплантатов их использование имеет ряд ограничений и осложнений, связанных с забором ткани у пациента. Процедура забора материала болезненна и травматична, может быть связана с последующими осложнениями [Cricchio, 2003; Joshi, 2004], а также имеет ограничения по допустимому объему забираемой костной ткани. Использование аутотрансплататов нежелательно в детском и пожилом возрасте. Невозможность использовать аутогенную кость для проведения методик направленной регенерации тканей может быть также связано с нежеланием пациентов идти на дополнительные вмешательства для получения костного материала. Осложнения при заборе аутотрансплантата происходят в 8.5-20% случаев и могут включать образование гематомы, потерю большого количества крови, повреждение нерва, образование грыжи, повреждение артерии, мочеточника, перелом в месте забора, косметические дефекты, трансплантацию опухоли, хроническую боль в месте забора [Hartigan, 2005].