Конструирование диагностикума с использованием наночастиц золота для определения активности антирабических сывороток и иммуноглобулина в дот-иммуноанализе

• Автор: Шарапова, Наталия Анатольевна
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Содержание
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус бешенства и методы его очистки и концентрирования

1.1.1. Свойства вируса бешенства

1.1.2. Очистка и концентрирование вируса бешенства

1.2. Методы обнаружения антирабических антител

1.3. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования
2.1.1. Вирусные антигены
2.1.2. Сыворотки и препараты
2.1.3. Лабораторные животные
2.2. Материалы и методы исследований
2.2.1. Реактивы и растворы
2.2.2. Приборы и оборудование
2.2.3. Осаждение virus fixe из мозговой суспензии
2.2.4. Очистка вируса бешенства
2.2.5. Выделение гликопротеида вируса бешенства
2.2.6. Определение белка
2.2.7. Получение золей золота
2.2.8. Конструирование конъюгатов коллоидного золота с иммунореагентами вирусной и иммуноглобулиновой природы
2.2.9. Иммуноферментный анализ
2.2.10. Дот-иммуноанализ
2.2.11. Статистическая обработка результатов исследований
ГЛАВ A3. ПОЛУЧЕНИЕ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ И КОНСТРУИРОВАНИЕ
КОНЪЮГАТОВ С НАНОЧАСТИЦАМИ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА
3.1. Отработка технологических приемов получения цельновирусных антигенов
органо-тканевого и культурального происхождения
3.2. Выделение гликопротеида вируса бешенства и его характеристика.
3.2.1. Характеристика антигенных свойств выделенного гликопротеида.
3.3. Получение наночастиц коллоидного золота
3.4. Отработка условий конструирования конъюгатов наночастиц золота с
иммунореагентами вирусной и иммуноглобулиновой природы
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ПРОТОТИПА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДНЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИРАБИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК И ИММУНОГЛОБУЛИНА in vitro В ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗЕ
4.1. Подбор твердой фазы для постановки дот-иммуноанализа
4.2. Определение специфической активности антирабического иммуноглобулина и иммунных сывороток в дот-анализе с применением сконструированной
тест-системы
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ДИАГНОСТИКУМА И ЕГО
КОМПОНЕНТОВ В ПРОЦЕССЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Актуальность проблемы бешенства обусловлена широким распространением инфекции и 100% летальностью [41].
В большинстве регионов России эпизоотическая и эпидемиологическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна и поэтому организация мер борьбы с опасной болезнью, общей для человека и животных, остается важной проблемой здравоохранения [50, 80, 83].
По данным экспертов ВОЗ, в 2011 г. около 55000 человек погибло после укусов животных, больных бешенством, преимущественно в Африке, Азии, Южной Америке [12, 101]. В Российской Федерации за аналогичный период от бешенства погибли 14 человек, из них 2 детей до 14 лет, в 2012 г. - 4 человека, из них 2 детей до 14 лет [29]. Ежегодно в различные лечебные учреждения РФ за медицинской помощью по поводу укусов и других повреждений, полученных от животных, обращаются более 450000 человек, примерно половина из них получают направление на специфическое антирабическое лечение [41, 55].
Для экстренной профилактики заболевания людей гидрофобией при тяжелых укусах бешеными или подозрительными на бешенство животными применяют антирабическую вакцину в сочетании с антирабическим иммуноглобулином [43, 55, 62]. В Российской Федерации единственным производителем гетерологичного антирабического иммуноглобулина является Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Антирабический иммуноглобулин, получаемый из сыворотки крови лошади, зарегистрирован и успешно применяется более 10 лет.
В настоящее время при производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина уровень активности антирабических сывороток продуцентов и готового препарата определяют in vivo в реакции нейтрализации вируса бешенства на белых мышах [144]. Данный метод трудоемок, требует большого количества животных, длительного времени наблюдения (14 дней) и предполагает использование инфекционного агента. В связи с этим актуальной является разработка ме-

- спектрофотометр СФ-56 с программным обеспечением, Россия - для определения оптической плотности золя золота и содержания белка во фракциях при выделении гликопротеида;
- электронный микроскоп HU-12A, «Hitachi», Япония - для электронно-микроскопического исследования наночастиц коллоидного золота;
- модульный спектрометр динамического и статического рассеивания света «Фотокор», Россия - для определения диаметра частиц коллоидного золота;
- сканирующий зондовый микроскоп Solver P47-PRO (NT-MD, Россия) с применением кремниевых кантелеверов NSG01 (NT-MD, Россия) - для анализа морфологических свойств полученного раствора коллоидного золота;
- холодильник «Атлант», Белоруссия - для хранения иммунных сывороток, аншрабического иммуноглобулина, раствора коллоидного золота и химических реактивов;
- морозильная камера «Sanyo», Япония - для хранения биологического материала (выделенного гликопротеида, антивидовых иммуноглобулинов);
- термостат ELMI ST-3L, Латвия - для инкубации нитроцеллюлозпой мембраны при постановке дот-иммупоапализа;
- дистиллятор GFL 2002, Россия - для получения воды очищенной;
- магнитная мешалка с электроподогревом ММ 2А, Россия - для приготовления коллоидного раствора;
- деионизатор ELGASTAT UHQ, Великобритания - для получения деионизованной воды;
-центрифуга лабораторная «К 23D», Германия - для осаждения антигена из вируссодержащей суспензии;
-центрифуга высокоскоростная для микрообъемов Eppendorf 5415 R, Германия - для осаждения гликопротеида;
- вытяжной шкаф «ФрескоЛаб», Россия - для храпения химических реактивов и работы с ними;