Изучение глутатионилирования Na,K-АТРазы под действием окисленного глутатиона

• Автор: Мэн Сяньюй
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ATP - аденозинтрифосфат

ADP - аденозиндифосфат

АМР - аденозинмонофосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДТТ - дитиотреитол

Е - фермент

ЕР - фосфорилированный фермент ИАФ - 5'-йодацетамидфлуоресцеин кДа - килодальтон

кДНК - кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота

Ml,...М10 - трансмембранные сегменты

NADH - никотинамиддинуклеотид восстановленный

NADPH- никотинамидцинуклеотидфосфат восстановленный
ПААГ - полиакриламидный гель
ПКА - протеинкиназа А
ПКС - протеинкиназа С
СР - саркоплазматический ретикулум
ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат
ФСБТ - фосфатно-солевой буфер (содержащий Твин-20)
цАМР - циклический аденозин-3',5'-монофосфат
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
GSH — восстановленный глутатион
GSSG - окисленный глутатион
ITC — изотермическая калориметрия титрования
MDCK - клеточная линия эпителия почек собаки
PBS - фосфатно-солевой буфер
PMSF - фенилметансулфонилфторид
SDS - додецилсульфат натрия
Tris - трис(гидроксиметил)аминомета

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ыа,К-зависимая аденозинтрифосфатаза
1.1. Общая характеристика 14а,К-АТРазы как АТРазы Р-типа
1. 2. Структура 14а,К-АТРазы
1.2. 1. Субъединичный состав 14а,К-АТРазы
1. 2. 2. а-Субъединица 14а, К-АТРазы
1. 2. 3. Основные конформационные состояния Иа,К-АТРазы..
1. 2. 4. Третичная структура а-субъединицы
1. 2. 5. Доменная организация а-субъединицы 14а,К-АТРазы.
1. 2. 6. Участки связывания катионов
1. 2. 7. (3-Субъединица 14а,К-АТРазы
1. 2. 8. у-Субъединица 14а,К-АТРазы
1. 2. 9. Четвертичная структура 14а,К-АТРазы
2.1. Уабаин - ингибитор 14а,К-АТРазы
2. 2. Изоформы субъединиц 14а,К-АТРазы
3.1. Механизм функционирования 14а,К-АТРазы
4. Глутатионилирование белков
4. 1. Окислительный стресс
4. 2. Глутатион
4. 3. Окислительная модификация БН-групп белков
4. 4. Механизм глутатионилирования белков
4. 5. Специфичность глутатионилирования белков
4. 6. Цистеиновые остатки 14а,К-АТРазы
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧА ИССЛЕДОВАНИЯ
МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ
5.1. Получение фракции микросом из и почек кролика
5.2. Получение фракции микросом из солевых желез уток
5.3. Очистка 14а,К-АТРазы из микросом солевых желёз утки и почек кролика
5.4. Получение фракции микросом из сердца крысы

клетки. Примеры этого - регуляция редокс-зависимых ядерных факторов транскрипции: ядерного фактора NF-кВ, белка р53 и белка-активатора 1, что обеспечивает экспрессию генов, вовлеченных в пролиферацию и дифференциацию клеток. Редокс-состояние может определять способность клеток входить в апоптоз или некроз (Moran, L.K., et al., 2001).
Редокс-состояние клетки поддерживается ферментативными и неферментативными системами. Состояние низкомолекулярных и белковые тиолов (SH-групп) - медиатор метаболических, сигнальных и транскрипционных процессов. Благодаря способности к обратимому окислению тиолы являются основными регуляторами редокс-состояния клетки, они являются редокс-чувствительными выключателями, регулируя прохождение сигналовза счет изменения соотношения ROS/RNS (Giustarini, D., et al., 2004b; Facundo, H.T, et al., 2007; Moriarty-Craige, S.E., et al., 2007).
Интенсивная продукция ROS или RNS, повреждение антиоксидантной защиты клетки или дисбаланс между ROS/RNS и антиоксидантами могут привести к патофизиологическим условиям, сопровождающимся изменением редокс-гомеостаза клетки. Дефицит витаминов С и Е, снижение активности антиоксидантых систем связаны с развитием многих заболеваний. Сис и Джонс (Sies, H., Jones D.P., 2007) дали определение окислительного стресса, согласно которому это «дисбаланс между оксидантами и антиоксидантами в пользу оксидантов, приводящий к нарушению редокс-сигнализации и контроля над разрушением молекул».
Окислительный стресс приводит к повреждению белков и нуклеиновых кислот, вызывая смерть клеток путем некроза или апоптоза. В норме антиоксидангая система действует как буфер для ROS и RNS, уменьшая окислительные повреждения, вызываемые этими молекулами. К антиоксидантам относятся ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза), а также ß-каротин (витамин А), аскорбиновая кислота (витамин С), а-токоферол (витамин Е), мочевая кислота и трипептид глутатион (GSH). Основным компонентом редокс-буфера клетки являются тиолы белков, их суммарная концентрация в клетке составляет 10-30 мМ (Schafer, F.Q., Buettner, G.R., 2001).
Окислительный стресс рассматривается как патогенный фактор многих заболеваний, включая сердечно-сосудистые, астму, сахарный диабет, ишемию-реперфузию. Он приводит к модификацииям определенных белков, влияя на их активность или функцию (Findlay, V.J., et al., 2006). Обратимые модификации остатков цистеина или метионина играют двойную роль: обеспечивают защиту от необратимого повреждения или измененяют функции белков