Фотоактивируемые флуоресцентные красители для микроскопии биологических объектов

• Автор: Шапошников, Михаил Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1Л. Флуоресценция и микроскопия. Теория вопроса и методы 10 изучения

1.1.1. Основы флуоресцентной микроскопии

1.1.2. Автофлуоресценция

1.1.3. Изучение процессов взаимодействия флуоресцентных красителей с мембранами и их транспорта в клетку

1.1.4. Применение флуоресцентных красителей в биологии и медицине

1.1.5. Применение ФФК в биологической микроскопии

1.2. Влияние среды окружения на флуоресценцию красителей

1.2.1. Вязкость окружения
1.2.2. Фиксаторы
1.2.3. Влияние pH на интенсивность флуоресценции
1.3. Фотоактивация ФФК
1.4. Фотообесцвечивание ФК
1.5. Выводы по обзору литературы
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Перечень используемых реактивов
2.2. Методики применявшиеся в работе
2.2.1. Методика приготовления растворов ФФК
2.2.2. Методика приготовления растворов ФК
2.2.3. Методика приготовления монослоя клеток
2.2.4. Методика окрашивания клеток и приготовление препаратов для микроскопии

3.3. Методы и приборы
3.3.1. Микроскопия препаратов
3.3.2. Методика вычисления колокализации красителя
3.3.3. Методика измерения спектров поглощения
3.3.4. Методика измерения спектров флуоресценции
3.3.5. Статистическая обработка результатов измерения спектров флуоресценции
3.3.6. Методика построения графиков в "Оп^тРго 8 "
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Спектральные характеристики ФФК-813 и ФФК-814 в растворе
3.2. Моделирование биологических мембран смешанными монослоями ФФК и фосфолипидов
3.3. Микроскопия препаратов, окрашенных ФФК-813 и ФФК-
3.4. Локальная активация фотоактивируемого флуоресцентного красителя в клетках
3.5. Микроскопия «нативных» клеток в реальном времени
3.6. Зависимость спектральных свойств ФФК от параметров среды
3.7. Определение локализации ФФК-813 в культуре клеток с помощью селективных флуоресцентных ЗОНДОВ
3.8. Получение конъюгата хитозана с фотоактивируемым флуоресцентным красителем и его визуализация в клетках
ВЫВОДЫ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
ПРИЛОЖЕНИЕ

Условные обозначения и сокращения
БСА бычий сывороточный альбумин
БЛМ бислойная липидная мембрана
ДМСО диметилсульфоксид
ДМФА диметилформамид
ДМФЭ димиристоилфосфатидилэтаноламин
мкл микролитры
нм нанометры
мкм микрометры
ТМР тетраметилродамин
ФБ фосфатный буфер
ФК флуоресцентные красители
ФСБ фосфатно-солевой буфер
ФФК фотоактивируемые флуоресцентные красители
Ф квантовый выход флуоресценции
А431 клеточная линия эпидермоидной карциномы человека
СНО клеточная линия яичника китайского хомяка
НаСаТ клеточная линия кератиноциты человека
HBL-100 клеточная линия рака молочной железы
HeLa клеточная линия карциномы шейки матки человека
I интенсивность флуоресценции
1/10 относительная интенсивность абсорбции
MDCK клеточная линия эпителий почки собаки
А, длина волны света
е коэффициент молярного поглощения (коэффициент
экстинкции)

Рис. 1.7. Фотолиз диазоетона 13 в метаноле со средним облучением ртутной лампой (150 В) оснащенной боросиликатным стеклянным фильтром (около 50% пропускания при 320 нм).
При освещении лампой, 1 мМ раствор соединения 13 сразу становится красным, продукты распада могут быть обнаружены в реакционной смеси а после 40 мин облучения исходное вещество полностью расходуется. Образование продуктов легко объясняется известными закономерностями [22]. Фотолиз а-диазокетонов сопровождается отщеплением азота и промежуточным образованием карбена (16С), участвующего в перегруппировке Вольфа. Получающийся кетен (16К) «перехватывается» любыми нуклеофилами, присутствующими в реакционной среде (водой, аминами, спиртами и т.д.). Эти подробно изученью преобразования удлиняют углеродной цепи на один атом [45]. Интересно, что фотолиз диазокетонов был также использован для «сшивки» амино-содержащих соединений [38]. Образование побочного нефлуоресцирующего продукта 14 можно объяснить миграцией связи “а” в карбене 16С. Основной красный флуоресцирующий продукт 15 получается в ходе перегруппировки Вольфа карбена 16С в кетен 16К (с миграцией связи “Ь”) в присутствии метанола, который