Принципы конструирования малых интерферирующих РНК для подавления экспрессии терапевтически значимых генов

• Автор: Черноловская, Елена Леонидовна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 330 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Интерферирующие РНК - селективные ингибиторы экспрессии генов 16 (Обзор литературы).

1.1. Механизм РНК интерференции

1.2. Природные интерферирующие РНК

1.2.1. РНК интерференция и противовирусная защита

1.2.2. Регуляторные РНК

1.2.3. Особенности механизма РНК интерференции у разных организмов

1.3. Способы получения интерферирующих РНК

1.4. Химические модификации в составе з1РНК

1.4.1. Типы химических модификаций
1.4.2. Выбор «направляющей цепи» в модифицированных дуплексах
1.4.3. «Включаемые» интерферирующие РНК
1.4.4. Нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия 39 интерферирующих РНК
1.4.5. Внутриклеточная локализация и биораспределение химически 41 модифицированных ыРНК
1.4.6. Биоконъюгаты БгРНК
1.5. Интерферирующие РНК с измененной структурой дуплекса
1.6. Влияние нуклеотидных замен на интерферирующую активность язРНК
1.7. Эффекты двуцепочечных РНК в клетке не связанные с интерференцией
1.8. Неспецифические эффекты з1РНК и способы их преодоления
1.9. Терапевтические мишени интерферирующих РНК
1.9.1. Ген множественной лекарственной устойчивости МИШ
1.9.2. Гены семейства МУС
1.9.3. НЕК2 (с-егЬ-В2ЛЧеи)
1.9.4. Циклин В1
1.9.5. Протеинкиназа С (РКС)
1.10. Перспективы использования интерферирующих РНК в медицине
1.11. Заключение
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Оборудование
2.1.3. Клеточные линии
2.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды, олигорибоиуклеотиды, ьгРНК и 83 дцРНК, использованные в работе
2.1.5. Растворы и буферы, использованные в работе
2.2. Методы
2.2.1. Получение и наработка плазмиды рЕСГР/АЮШ
2.2.1.1. Трансформация компетентных клеток Е. соИ штамма ОН5а
2.2.1.2. Выделение плазмидиой ДНК
2.2.1.3. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.2.1.4. Реакция лигирования Т4 ДНКлигазой
2.2.1.5. Получение плазмиды pEGFP/MDRl
2.2.2. Формирование дуплексов siPHK
2.2.3 . Определение температуры плавления siPHK
2.2.4. Введение остатка флуоресцеина в siPHK
2.2.5. Ферментативный синтез длинных дцРНК
2.2.6. Очистка ферментативно синтезированных длинных дцРНК
2.2.7. Ферментативный синтез siPHK
2.2.7.1. Получение дцЦНК-матриц в реакции с фрагментом Клепова
2.2.7.2. In vitro транскрипция
2.2.7.3. Выделение транскриптов
2.2.7.4. Гибридизация РНК-транскриптов и гидролиз РНКазой Т1
2.2.8. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот
2.2.8.1. Электрофорез дуплексов в ПААГ в нативных условиях
2.2.8.2. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.8.3. Электрофорез в агарозном геле
2.2.9. Исследование нуклеазоустойчивости siPHK в ростовой среде с 98 эмбриональной бычьей сывороткой
2.2.10. Картирование нуклеазочувствительных сайтов siPHK
2.2.10.1. Введение [32Р]-метки по 5 '-концу олигорибонуклеотидов
2.2.10.2. Введение [32Р] - метки по 3 ’-концу олигорибонуклеотидов
2.2.10.3. Статистическое расщепление олигорибонуклеотидов 99 имидазолом
2.2.10.4. Расщепление олигорибонуклеотидов рибонуклеазой Т1
2.2.10.5. Исследование паттерна деградации siPHK дуплексов в ростовой среде DMEMc 10 %-ной FBS
2.2.11. Исследование эффективности подавления экспрессии гена EGFP/MDR1 под действием анти-MDRl siPHK
2.2.11.1. Исследование биологической активности siPHK методом флуоресцентной микроскопии
2.2.11.2. Исследование биологической активности siPHK методом проточной цитофлуорометрии
2.2.12. Исследование эффективности накопления FlTC-меченых siPHK в клетках
2.2.12.1. Оценка эффективности трансфещии клеток с помощью проточной цитофлуорометрии
2.2.12.2. Конфокальная флуоресцентная микроскопия
2.2.13. Исследование эффективности подавления синтеза Р-гликопротеина в клетках КВ-8-5 с помощью анти-MDRl siPHK
2.2.13.1. Вестерн блот анализ (определение количества суммарного белка Р-гликопротеина)
2.2.13.2. Оценка уровня подавления мембранного Р-гликопротеина с помощью проточной цитофлуорометрии
2.2.13.3. Измерение функциональной активности Р-гликопротеина
2.2.14. Приготовление препаратов для измерения методом проточной

цитофлуорометрии
2.2.15. Определение чувствительности теток к винбластину (МТТ-mecm)
2.2.16. Исследование биологической активности дцРНК и siPHK, направленных на мРНК генов C-MYC, HER2, CCNB1 и РКС
2.2.16.1. Трансфекция клеток siPHK и длинными дцРНК
2.2.16.2. Определение количества живых клеток (MIT-тест)
2.2.16.3. Микроскопический анализ
2.2.16.4. Определение доли мёртвых и вошедших в стадию апоптоза клеток в популяции
2.2.16.5. Выделение суммарной клеточной РНК
2.2.16.6. Обратная транскрипция (получение кДНК)
2.2.16.7. ПЦР
2.2.17. Исследование иммуностимулирующих свойств isPHK
2.2.17.1. Лабораторные животные и опухолевые модели
2.2.17.2. Выделение моноцитарно-лимфоцитарной фракции из периферической крови человека
2.2.17.3. Определение концентрации ИФН-а, ФНО-а и ИЛ-6 в культуральной среде РВМС с помощью иммуноферментного анализа
2.2.17.4. Исследование иммуностимулирующих свойств isPHK in vivo
2.2.17.5. Исследование противоопухолевой активности isPHK in vivo
па модели опухоли гепатокарциномы G
2.2.17.6. Исследование противоопухолевой активности isPHK in vivo
иа модели опухоли меланомы В16
2.2.77.7. Исследование антиметастатической активности isPHK in vivo на модели опухоли меланомы В16
2.2.18. Статистика
ГЛАВА 3. Принципы конструирования малых интерферирующих РНК для подавления экспрессии терапевтически значимых генов (Результаты и их обсуждение)
3.1. Выбор мишеней для siPHK в составе мРНК
3.1.1. Исследование эффективности подавления экспрессии гена MDR1
под действием siPHK
3.1.1.1 Изменение уровня мРНК гена MDR1 под действием siPHK
3.1.1.2 Восстановление чувствительности клеток к цитостатикам
под действием siPHK
3.1.2. Влияние выбора мишени в составе мРНК гена MDR1 на эффективность подавления экспрессии этого гена под действием siPHK
3.1.2.1. Восстановление чувствительности клеток к винбластину под действием siPHK, направленных к различным участкам мРНК гена
MDR1
3.1.2.2. Изменение уровня Р-гликопротеина под действием siPHK, направленных к различным участкам мРНК гена MDR1
3.1.2.3. Изменение накопления субстрата Р-гликопротеина родамина 123 под действием siPHK, направленных к различным участкам мРНК

дестабилизировать дуплекс (DNA, 2'-АЕМ, 2'-АРМ, ОХ, 2'-ЕА, 2'-АР, 2'-СЕ, UNA). В комплексном исследовании, описанном в [135] было проведено прямое сравнение влияния 21 типа химических модификаций на интерферирующую активность siPHK и жизнеспособность клеток трансфицированных этими siPHK. Всего в этом исследовании, направленном на получение siPHK с улучшенными свойствами, было использовано 2160 siPHK дуплексов, содержащих различные комбинации химических модификаций. Полученные данные показали, что механизм РНК интерференции более толерантен к модификациям в составе смысловой цепи: более активные siPHK содержали меньшее суммарное количество модификаций в составе дуплекса и меньшее количество модификаций в составе антисмысловой цепи. Наибольший положительный эффект на активность siPHK оказали химические модификации, обеспечивший предпочтительное включение в RISC антисмысловой цепи путем создания благоприятной термодинамической асимметрии дуплекса. Тем не менее, введение большого количества модифицированных звеньев, приводящее к существенному увеличению общей термодинамической стабильности дуплекса, снижает интерферирующую активность siPHK. Этот факт указывает на важную роль дестабилизирующих модификаций (например, таких как UNA [135]) в создании благоприятной термоасимметрии [136].
Структура выступающих 3’-концов siPHK дуплекса является еще одним важным параметром, влияющим на выбор направляющей цепи и интерферирующию активность дуплекса в целом. Ранее считалось, что выступающие концы длиной 2-3 нуклеотида могут иметь любую последовательность, даже состоять из дезоксирибонуклеотидов, что упрощает и удешевляет синтез siPHK, однако, последние данные показали их влияние на активность siPHK [138, 139]. Доказано, что химические модификации, введенные в состав 3’-выступающих концов siPHK могут влиять на их активность либо путем стабилизации/дестабилизации дуплекса, либо через взаимодействие с белковыми компонентами, участвующими в РНК интерференции, либо защищая siPHK от деградации рибонуклеазами (проблема нуклеазоустойчивости будет позже рассмотрена в этом обзоре более подробно).
Ш-фенилкарбамоил-цитозин (N4-CPP) - модифицированное азотистое основание, при введении которого в выступающие концы ДНК-дуплексов наблюдается их стабилизация за счет стеккинг-взаимодействий [ 140 ]. Недавно было предложено использовать эту модификацию для получения химически модифицированных siPHK, предназначенных для подавления экспрессии химерного гена bcr-abl в клетках линии К-562 [ 141 ]. Было показано, что введение такого модифицированного основания в