Взаимодействие малого белка теплового шока HSPB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3

• Автор: Судницына, Мария Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Семейство малых белков теплового шока. Структура и свойства

2. Малый белок теплового шока ШрВб

2.1 Общая характеристика НврВб

2.1.1 Структура и физико-химические свойства НврВб

2.1.2 Экспрессия, тканевое распределение и внутриклеточная локализация НврВб

2.1.3 Фосфорилирование НврВб

2.1.4 Шапероноподобная активность НврВб

2.2 Возможная функциональная роль НБрВб
2.2.1 Кардиопротекторная функция НврВб
2.2.2 Влияние НврВб на процесс агрегации тромбоцитов
2.2.3 Участие НзрВб в регуляции сократительной активности гладкой мускулатуры
3. Белки семейства
3.1 Изоформенный состав, экспрессия и тканевое распределение белков семейства
3.2 Структурная организация
3.3 Взаимодействие 14-3-3 с белками-партнерами
3.4 Регуляция 14-3-3 путем фосфорилирования
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Получение рекомбинантных белков
1.1. Получение рекомбинантного №рВ6 человека
1.1.1. Экспрессия рекомбинантного НзрВб
1.1.2. Выделение рекомбинантного НярВб
1.2 Получение рекомбинантного 14-3-3 человека и его мутантных форм
1.3. Получение рекомбинантных кофилина-1 и кофилина-2 человека и их мутантных форм, имитирующих фосфорилирование
1.3.1. Получение молекулярных конструкций для экспрессии мутантных форм
кофилина-1 и кофилина
1.3.2. Экспрессия рекомбинантных кофилина-1, кофилина-2 и их мутантных форм, имитирующих фосфоричирование

1.3.3 Выделение рекомбинантных кофилина-1, кофилина-2 и их мутантных форм, имитирующих фосфорилирование
I.4. Получение рекомбинантного каталитического домена LIM-киназы
1.4.1. Получение молекулярной конструкции для экспрессии каталитического домена LIM-киназы
1.4.2. Экспрессия каталитического домена LIM-киназы
1.4.3. Выделение рекомбинантного каталитического домена LIM-киназы
2. Получение компетентных клеток
3. Выделение актина из ацетонового порошка
4. Фосфорилирование белков
4.1. Фосфорилирование HspB6 протеинкиназой А
4.2. Фосфорилирование кофилина рекомбинантным каталитическим доменом LIM-киназы
5. Метод химической «сшивки»
6. Нативный электрофорез
6.1. Нативный электрофорез для исследования взаимодействия HspB6 и кофилина с
6.2. Нативный электрофорез для исследования влияния 14-3-3 на взаимодействие
кофилина с актином
7. Г ель-фильтрация
8. Иммуно преципитация
8.1. Приготовление сефарозы с иммобилизованными антителами
8.2 Иммунопреципитация HspB6
9. Метод наслаивания (overlay)
9.1. Метод наслаивания с последующей авторадиографией
9.2. Метод наслаивания с последующей окраской антителами
10. Коседиментация
11. Электрофорез в денатурирующих условиях
II.1. SDS-электрофорез
11.2. Электрофорез в присутствии мочевины
12. Окрашивание гелей серебром
13. Авторадиография
14. Спектрофотометрическое определение концентрации белка
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
1. Получение рекомбинантного HspB6 человека

2. Фосфорилирование ШрВб протеинкиназой А
3. Взаимодействие НврВб с 14-3-3£
3.1 Взаимодействие НэрВб с мутантньми формами 14-3-3, имитирующими
фосфорилирование
3.2 Взаимодействие НврВб с мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры
4. Получение рекомбинантных кофилина-1, кофилина-2 и их мутантных форм,
имитирующих фосфорилирование
5. Получение рекомбинантного каталитического домена ЫМ-киназы
6. Фосфорилирование кофилина каталитическим доменом ЫМ-киназы
7. Взаимодействие 14-3-3 с кофилином и влияние ШрВб на это взаимодействие
7.1 Взаимодействие 14-3-3 с кофилином
7.2 Влияние 14-3-3 на взаимодействие кофилина с Р-актином
7.3 Влияние 14-3-3 на взаимодействие кофилина с в-актином
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

отделяли, а осадок ресуспеидировали в 20 мл лизис-буфера. Процедуру экстракции, начиная с обработки ультразвуком, повторяли еще два раза. Полученные супернатанты объединяли, добавляли сульфат аммония до степени насыщения 30% и инкубировали 1 ч на льду при постоянном перемешивании. По окончании периода инкубации суспензию центрифугировали 15 мин при 23700 g, осадок растворяли в 15 мл буфера Б (20 мМ трис/ацетат, pH 7,6, 10 мМ ЫаС1, 0,1 мМ ЭДТА, 14 мМ |3-МЭ, 0,1 мМ ФМСФ) и диализовали против 2 л буфера Б в течение ночи.
На следующем этапе частично очищенный препарат НьрВб подвергали дальнейшей очистке с помощью хроматографических методов. Препарат НьрВб после диализа центрифугировали (30 мин при 105000 g), разводили в 4 раза и наносили порциями на колонку НіТгарС» (АтегхЬат-РІїагтасіа) объемом 5 мл, предварительно уравновешенную буфером Б. Колонку промывали 4 объемами буфера Б, затем проводили элюцию линейным градиентом ІЧаСІ от 10 до 360 мМ в 12 объемах колонки. Во время проведения хроматографии собирали фракции объемом 1 мл, состав которых анализировали при помощи БББ-электрофореза (см. раздел 11.1). Фракции, содержащие наибольшее количество НэрВб объединяли и подвергали дополнительной очистке с помощью метода гидрофобной хроматографии. К полученному препарату НэрВб добавляли сульфат аммония до концентрации 0,3 М и наносили его порциями на колонку РЬепуІНР НіТгар (АтегьЬат РЬагтасіа) объемом 5 мл, предварительно уравновешенную буфером Б, содержащим 0,3 М сульфата аммония. Колонку промывали 4 объемами буфера уравновешивания, затем проводили элюцию в два этапа линейным градиентом (ІЧНДгБОф На первой стадии (7 объемов колонки) концентрация сульфата аммония уменьшалась с 300 до 15 мМ, а на второй стадии (10 объемов колонки) концентрация сульфат аммония уменьшалась с 15 до 0 мМ. Во время проведения хроматографии собирали фракции объемом 1 мл, состав которых анализировали при помощи БОБ-электрофореза (см. раздел 11.1). Фракции, содержащие наибольшее количество целевого белка, объединяли, концентрировали при помощи ультрафильтрации и диализовали в течение ночи против 2 л буфера Б, содержащего 1 мМ ДТТ вместо (3-МЭ. Концентрацию белка в конечном препарате определяли спектрофотометрически, принимая коэффициент экстинкции ШрВб при 280 нм равным 0,582 (мг/мл)"'-см"1. Выход белка сіл бактериальной культуры составил ~80 мг. Полученный препарат делили на аликвоты и хранили при -20°С.