Инактивация вирусов искусственными рибонуклеазами

• Автор: Федорова, Антонина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 150 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСОВ ХИМИЧЕСКИМИ РЕАГЕНТАМИ С ШИРОКИМ СПЕКТРОМ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Разнообразие вирусов

1.2 Особенности строения и жизненного цикла безоболочечных вирусов,

влияющие на их инактивацию химическими реагентами

1.3 Особенности строения и жизненного цикла оболочечных вирусов,

влияющие на их инактивацию химическими реагентами

1.4 Вирусы, использованные в настоящей работе

1.4.1 Вирус энцефаломиокардита мышей и семейство Ргсогцдуг>гй?ое

1.4.2 Вирус острого паралича пчел и семейство й1а$1гоу1г1с1ае
1.4.3 Вирус гриппа и семейство ОпНотухоутйае
1.4.4 Вирус осповакцины
1.5 Химические реагенты, обладающие противовирусной активностью
1.5.1 Определение количества вирусных частиц
1.5.2 Г ен ом-направленные реагенты
1.5.2.1 Алкилирующие агенты
1.5.2.2 Искусственные рибонуклеазы
1.5.3 Липиды
1.5.4 Гидрофобные поликатионы
1.5.5 Полианионы
1.5.6 Поверхностно-активные вещества
1.5.7 Химические реагенты в приготовлении вакцин
1.5.7.1 Формальдегид
1.5.7.2 Диметиленимин
1.5.8 Заключение по обзору
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы и реактивы
2.1.1 Реактивы и препараты
2.1.2 Оборудование
2.1.3 Клеточные линии
2.1.4 Олигонуклеотиды
2.1.5 Вирусы

2.1.6 Лабораторные животные
2Л .7 Растворы и буферы, использованные в работе
2.2 Методы
2.2.1 Г ель-электрофорез
2.2.1.1 Гель-электрофорез в агарозном геле
2.2.1.2 SDS полиакриламидный гель-электрофорез
2.2.1.3 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.2 Получение и очистка EMCV
2.2.3 Получение и очистка ВОВ
2.2.4 Проведение инъекций личинкам пчел и молодым пчелам
2.2.5 Токсичность аРНКаз
2.2.5.1 Оценка токсичности аРНКаз для личинок пчел
2.2.5.2 Оценка токсичности аРНКаз для клеточных культур: МТТ тест
2.2.6 Титрование вирусов
2.2.6.1 Определение количества инфекционного ABPV
2.2.6.1.1 Определение летальной дозы ABPV для личинок пчел и молодых пчел
2.2.6.2 Титрование EMCV методом бляшкообразующих единиц
2.2.6.3 Титрование ВОВ методом бляшкообразующих единиц
2.2.6.4 Определение титра вируса гриппа на клетках по реакции окрашивания
инфекционных фокусов
2.2.7 Оценка противовирусного действия аРНКаз
2.2.7.1 Оценка противовирусной активности аРНКаз in vivo
2.2.7.1.1 Инактивация ABPV
2.2.7.1.2 Оценка полноты инактивации ABPV
2.2.7.1.3 Анализ гемолимфы личинок
2.2.7.2 Оценка противовирусной активности аРНКаз in vitro
2.2.7.2.1 Инактивация EMCV
22.1.2.2 Инактивация вируса гриппа
2.2.7.2.3 Инактивация вируса осповакцины
2.2.7.2.3.1 Алкилирование гистидина в аРНКазе ABL3C3
2.2.8 Амплификация вирусных РНК
2.2.8.1 Экстракция РНК
2.2.8.2 Обратная транскрипция
2.2.8.3 Полимеразная цепная реакция
2.2.8.4 Исследование морфологии ABPV в процессе инактивации аРНКазой
Dpl2F6

2.2.9 Исследование мембранолитической активности аРНКаз
2.2.10 Исследование хаотропной активности аРНКаз: инактивация человеческой
эндонуклеазы hFEN-1 человека
2.2.10.1 Введение [j2P]-MeTKH по 5 -концу олигонуклеотида ONT26
2.2.10.2 Расщепление субстратных комплексов Ь2 и ONt26 hFEN
2.2.10.3 Инактивация hFEN
ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМ ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСОВ ИСКУССТВЕННЫМИ РИБОНУКЛЕАЗАМИ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ)
3.1 Оценка противовирусной активности аРНКаз
3.1.1 Противовирусная активность аРНКаз по отношению к ABPV
3.1.1.1 In vivo скрининг на модели ABPV/личинки пчел Apis Mellifera
3.1.1.2 Патогенность ABPV для личинок и молодых пчел Apis Mellifera
3.1.1.3 Токсичность аРНКаз
3.1.1.4 Инактивация ABPV
3.1.1.5 Выводы
3.1.2 Противовирусная активность аРНКаз по отношению к EMCV
3.1.2.1 Выводы
3.1.3 Противовирусная активность аРНКаз по отношению к вирусу гриппа
A/WSN33 НИМ)
3.1.3.1 Выводы
3.2 Механизм инактивации вирусов аРНКазами
3.2.1 Анализ целостности вирусных РНК
3.2.1.1 Расщепление РНК ABPV
3.2.1.2 Расщепление РНК EMCV
3.2.1.3 Расщепление РНК вируса гриппа
3.2.2 Изучение морфологии вирусных частиц после инактивации аРНКазами
3.2.3 Выводы
3.3 Исследование спектра активностей аРНКаз
3.3.1 Исследование хаотропной активности аРНКаз
3.3.1.1 Описание модельной системы
3.3.1.2 Инактивация hFEN-1 аРНКазами и мочевиной
3.3.2 Исследование мембранолитической активности аРНКаз
3.3.2.1 Выводы
3.4 Инактивация ДНК-вируса осповакцины
3.4.1 Скрининг соединений, проявляющих анти-ВОВ активность
3.4.2 Кинетический профиль инактивации ВОВ

Спустя 1 ч после инфицирования клетки вирусом в цитоплазме происходит образование «вирусных фабрик» - крупных структур, в которых вирусные факторы с использованием клеточных компонентов создают репликативные комплексы [140]. Сборка частиц ВОВ происходит через ряд промежуточных структур по мере завершения репликации генома вируса. Вирионы поксвирусов существуют в виде трех инфекционных форм: зрелый, оболочечный, а также внеклеточный вирионы (Рисунок 17) [141]. Формирование сферического незрелого вируса происходит из серповидных модифицированных мембран и геномной ДНК. В результате дальнейших значительных структурных преобразований, протеолитического расщепления нескольких белков кора и формирования дисульфидных связей, стабилизирующих структуру вириона, из незрелого вируса происходит формирование зрелых вирионов. Зрелые вирионы представляют собой мембранные частицы, содержащие двояковогнутый, ДНК-содержащий кор, фланкированный двумя латеральными телами, которые заполняют впадины на коре (Рисунок 17). Зрелый вирус практически всегда находится только внутри клетки, а его высвобождение происходит только в результате лизиса клетки [142]. Очень небольшая доля оболочечного вируса выходит во внеклеточное пространство и находится там в прикрепленном к поверхности клетки состоянии либо в свободном состоянии во внеклеточной среде. Предполагается, что такой оболочечный вирус является ответственным за распространение вируса по организму.
На рисунке 18 представлена трехмерная визуализация вирусных частиц осповакцины: вирионы имеют кирпиче-образную форму, слегка сжаты по продольной оси и имеют размер 350 - 370 х 250 х 270 нм. Зрелый внутриклеточный вирион содержит мембрану, полностью соответствующую липидной мембране (толщина 5 — 6 нм), и покрыт поверхностными трубчатыми элементами (STE, surface tuble elements), которые представляют собой целостные белковые комплексы, выступающие с поверхности частиц на ~ 3 - 5 нм, и выполняющие роль внешних рецептор-связывающих компонентов вируса [143]: вирусные белки А16, А21, А28, G3, G9, Н2, J5 и L5 образуют белковые комплексы, которые принимают участие в процессе вирусного слияния с клеткой и проникновения в нее. Как и многие другие вирусы, например, вирус герпеса, папиломавирус, парамиксовирус и флавивирус, ВОВ специфически взаимодействует с глюкозаминогликанами, что определяет круг их хозяев. Например, известно, что вирусный белок А26, входящий в состав STE, взаимодействует с ламинином - белком из семейства крупных адгезивных гликопротеинов, которые являются основными компонентами базальных мембран и выполняют множество функций.