Характеристика изоформ лакказы гриба Cerrena unicolor

• Автор: Лисова, Зоя Александровна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 193 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ЛАККАЗА. ОБЩЕЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ФЕРМЕНТЕ

1.1.1. История открытия

1.1.2. Лакказа - представитель семейства «голубых» медьсодержащих оксидаз.

1.1.3. Распространение в природе

1.1.4. Функции лакказы

1.1.5. Локализация лакказы

1Л.6. Молекулярные свойства лакказы

1.2. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ЛАККАЗЫ
1.3. СТРУКТУРА ЛАККАЗЫ
1.3.1. Строение активного центра лакказ
1.3.2. «Необычные» лакказы
1.3.3. Трехмерная структура лакказы
1.4. ТИПЫ СУБСТРАТОВ, ОКИСЛЯЕМЫХ ЛАККАЗОЙ
1.5. МЕХАНИЗМ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЛАККАЗЫ
1.5.1. Каталитический цикл лакказы
1.5.2. Механизм восстановления кислорода в трехъядерном кластере
1.6. ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ РЕАКЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ ЛАККАЗ
1.6.1. Разница окислительно—восстановительных потенциалов Т1 центра и субстрата и факторы, влияющие на величину редокс-потенциала Т1 центра лакказ
1.6.2. Стерическое соответствие молекулы субстрата субстратсвязывающему центру лакказы
1.6.3. Энергия реорганизации
1.7. ЭФФЕКТ «МЕДИАТОРОВ»
1.8. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАККАЗ
1.8.1. Каталитические параметры реакций окисления субстратов лакказами
1.8.2. pH Оптимум
1.8.3. Температурный оптимум окисления субстрата и термостабильность лакказ..
1.8.4. Ингибиторы лакказной активности
1.9. ПРИКЛАДНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЛАККАЗЫ
1.9.1. Применение лакказы в целлюлозно-бумажной промышленности
1.9.2. Применение лакказы в текстильной промышленности
1.9.3. Применение лакказы в пищевой промышленности

1.9.4. Использование лакказы в производстве технического спирта
1.9.5. Биорсмедиация с помощью лакказы
1.9.6. Применение лакказы в косметической промышленности
1.9.7. Применение лакказы в органическом синтезе
1.9.8. Биосенсоры, электроиммуноанализ и биотопливные элементы
на основе лакказы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования и условия культивирования
2.2. Скрининг грибов - продуцентов лакказы
2.3. Очистка фермента
2.4. Определение активности лакказы и концентрации белка
2.5. Характеристика фермента
2.5.1. Электрофорез. Определение молекулярной массы
2.5.2. Аналитическая изоэлектрофокусировка.
Определение изоэлектрических точек
2.5.3. Определение спектральных характеристик
2.5.4.Определение углеводного состава
2.5.5. Дсгликозилирование лакказы
2.5.6. Определение оптимумов и стабильности фермента
2.5.7. Определение каталитических свойств
2.5.8. Определение N-концевых последовательностей
2.5.9. Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле
2.5.10. MALDITOF MS анализ
2.6. Молекулярно-генетические методы
2.6.1. Выделение геномной ДНК
2.6.2. Амплификация гена лакказы с геномной ДНК
2.6.3. Очистка ПЦР-фрагментов с помощью препаративного электрофореза
2.6.4. Лигирование ПЦР-продукта
2.6.5. Получение компетентных клеток E. coli
2.6.6. Трансформация компетентных клеток E. coli
2.6.7. Отбор клонов и скрининг
2.6.8. Выделение плазмидной ДНК из E. coli
2.6.9. Секвенирование
2.6.10. Выделение и очистка суммарной РНК C. unicolor ВКМ F-3
2.6.11. Синтез, амплификация кДНК и секвенирование

2.7. Компьютерное моделирование
2.8. Реакция лакказы с пентахлорфенолом (ПХФ) и идентификация продуктов
2.9. Синтез лигниноподобных водорастворимых полимеров (ЛВП)
2.10. Определение токсичности ЛВП в отношении клеток
2.11. Исследование антивирусной активности ЛВП
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Скрининг грибов-продуцентов лакказы и отбор наиболее эффективного продуцента лакказы
3.2. Изучение индукции лакказы гриба С. итсо1ог
3.3. Оптимизация условий очистки изоформ лакказы
3.4. Характеристика лакказ
3.4.1. Молекулярные свойства ЬасС1 и ЬасС
3.4.2. Спектральные свойства ЬасС1 иЬасС
3.4.3. Каталитические свойства ЬасС1 и ЬасС
3.4.4. МА1Л91 ТОР МБ анализ и определение Ы—концевых аминокислотных последовательностей лакказ ЬасС1 иЬасС
3.5. Анализ нуклеотидных последовательностей генов лакказ ЬасС1 и ЬасС
и определение аминокислотных последовательностей лакказ
3.6. Изучение структурной организации лакказ
3.7. Трансформация пеитахлорфенола лакказой ЬасС
3.8. Синтез лигниноподобных водорастворимых полимеров (ЛВП)
с участием лакказы и исследование их антивирусной активности
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ
Приложение

прикрепленная к молекуле белка через аспарагиновый остаток (Лепя), связана водородными связями с поверхностью белковой молекулы либо непосредственно, либо через молекулы воды. При этом образуются как внутримолекулярные связи, так и межмолекулярные связи с соседними молекулами лакказы, вследствие чего образуется ригидная структура самой белковой молекулы и упорядоченная сеть углеводных остатков (ЬуаэЬепко е1 а1., 2006а) (рис. 3).
Рисунок 3. Углеводная цепь при Asns4 в молекуле лакказы С. maxima образует водородные связи с другими молекулами лакказы в кристаллографической ячейке (Zhukhlistova et al., 2008).
Моноядерный Т1 центр расположен в третьем домене, он несколько погружен вглубь белковой молекулы (например, в лакказе Т. versicolor Cul расположен на глубине 6,5 Ä от поверхности фермента (Piontek et al., 2002)). Атом меди Cul Т1 центра координирован в белковой молекуле двумя гистидиновыми остатками и одним остатком цистеина, расположенными в одной плоскости с Cul, в результате чего Т1 центр приобретает планарную тригональную структуру (конфигурацию). Cul образует прочную ковалентную л-связь с атомом SG цистеина, перенос заряда через которую вызывает появление максимума в видимой области при 600 нм и приводит к появлению интенсивной голубой окраски фермента. Аксиальное положение в координационной сфере Т1 центра может занимать Met, как это имеет место в аскорбатоксидазе, растительных лакказах, бактериальной лакказе CotA В. subtilis и лакказе CueO E. coli (Messerschmidt, 1997; Enguita et al. 2003, Roberts et al., 2002). У грибных лакказ в аксиальном положении находится алифатичесие или ароматические аминокислотные