Изоцитратлиаза из сои : очистка, каталитические характеристики, идентификация генов icl1 и icl2 и регуляция их экспрессии

• Автор: Чан Тхи Хоанг Куен
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 161 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Распространение глиоксилатного цикла, динамика активности изоцитратлиазы в растениях и её изоферментный состав

1.1.1. Распространение глиоксилатного цикла

1.1.1.1. Распространение глиоксилатного цикла у растений

1.1.1.2. Распространение глиоксилатного цикла у

микроорганизмов

1.1.1.3. Распространение глиоксилатного цикла у животных

1.1.2. Динамика активности изоцитратлиазы в растениях

1.1.3. Изоферментный состав
1.2. Субклеточная локализация изоцитратлиазы
1.3. Анализ схемы очистки изоцитратлиазы
1.3.1. Разрушение клеток и экстракция
1.3.2. Фракционирование солями
1.3.3. Гель-фильтрация
1.3.4. Аффинная хроматография
1.3.5. Ионообменная хроматография
1.4. Кинетические и регуляторные свойства изоцитратлиазы
1.4.1. Колебание значений константы Михаэлиса-Ментен
1.4.2. Значения pH оптимума
1.4.3. Величины температурного оптимума
1.4.4. Влияние катионов металлов
1.4.5. Действие метаболитов
1.5. Молекулярные аспекты функционирования изоферментов изоцитратлиазы
1.5.1. Идентификация генов изоцитратлиазы
1.5.2. Роль дифференциальной экспрессии генов в адаптации и развитии организмов и факторы экспрессии

1.5.2.1. Роль дифференциальной экспрессии генов
1.5.2.2. Факторы экспрессии
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Цель и задачи
2.2. Объекты и методы исследования
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Схема очистки изоцитратлиазы
2.2.2.1.1. Получение экстрактов
2.2.2.1.2 Высаливание сульфатом аммония
2.2.2.1.3. Гель-фильтрация на сефадексе
2.2.2.1.4. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе
2.2.2.1.5. Гель-хроматография на сефадексе
2.2.2.2. Определение активности ферментов
2.2.2.3. Определение количества белка
2.2.2.4. Определение молекулярной массы нативного фермента
2.2.2.5. Электрофоретические исследования
2.2.2.5.1. Определение гомогенности ферментов
2.2.2.5.2. Специфическое проявление изоцитратлиазы
2.1.2.5.3. Определение молекулярной массы субъединиц фермента методом ЗВБ-ПААГ-электрофореза
2.2.2.6. Субклеточная локализация изоцитратлиазы
2.2.2.6.1. Дифференциальное центрифугирование
2.2.2.6.1. Изоплотностное центрифугирование
2.2.2.7. Кинетические характеристики и регуляция активности ферментов
22.2.1.1. Величины константы Михаэлиса-Ментен
22.2.1.2. Значения pH оптимума
2.2.2.7.3. Влияние катионов металлов на активность

изоформ
2.2.2.7.4. Регуляция метаболитами
2.2.2.8. Разработка условий длительного хранения изоцитратлиазы
2.2.2.9. Идентификация генов ich и ich и регуляция их экспрессии
2.2.2.9.1. Экстракция суммарной РНК по методу фенол-хлороформной экстракции
2.2.2.9.2. Экстракция суммарной РНК помощью колонок Bio-Rad
2.2.2.9.3. Выделение геномной ДНК с мочевиной
2.2.2.9.4. Определение количества РНК
2.2.2.9.5. Определение количества ДНК
2.2.2.9.6. Проведение обратной транскрипции мРНК
22.2.9.1. Подбор праймеров
2.2.2.9.8. Проведение полимеразной цепной реакции
2.2.2.9.9. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени
2.2.2.9.10. Выделение ДНК из полиакриламидных гелей
2.2.2.9.11. Секвенирование ПЦР-продукта
2.2.2.9.12 Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот
2.2.2.10. Статистическая обработка данных
2.3. Результаты и их обсуждение
2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы в прорастающих семенах сои разных сортов
2.3.2. Субклеточная локализация изоферментов изоцитратлиазы
в прорастающих семенах сои
2.3.3. Очистка изоцитратлиазы из сои разных сортов
2.3.3.1........Очистка изоцитратлиазы из сои вьетнамского сорта «DT-84»

сорбция происходит за счёт специфических сил сродства, лежащих в основе биологической активности фермента [46].
При очистке ИЦЛ из Colwellia maris ферментный препарат после стадии высаливания сульфатом аммония был нанесён на колонку с фенил-сефарозой CL-4B, уравновешенную буфером. Фермент элюировали 200 мл обратного линейного градиента 1,0 М (NH4)2S04 в буфере. Фракции с высокой активностю ферментов были объединены, диализованы против буфера, содержащего 10 % глицерина и 4мМ DL-изоцитрат и хранили при -35°С [206,207]. Белки фракционировали на сефарозе CL-6B [172], или фенил-сефарозе [72, 144].
1,3.5. Ионообменная хроматография
В основе ионообменной хроматографии лежат реакции ионного обмена между белками и различными ионообменниками [8]. При очистке арахиса, после фракционирования сульфатом аммония к раствору фермента добавили Triton Х-100, концентрация которого достигала 0,2%. После этого фермент наносили на ионообменную колонку ДЭАЭ-целлюлозы (Sigma-Aldrich, St Louis, МО) для разделения. Каждая проба объёмом по 2 мл (около 15 мг/мл белка) была нанесена и элюирована буфером со скоростью на 0,8 мл/мин, и объём каждой фракции 3 мл. Активные фракции были объединены и сконцентрированы трубкой UF (Amicon Ultracel PL-ЗО приборы центробежного фильтра, Со. ' Millipore, Bedford, MA) до конечной концентрации белка около 15 мг/мл [116]. При очистке ИЦЛ из Colwellia maris диализованный раствор фермента был нанесён на колонку ДЭАЭ-целлюлозы, уравновешенную буфером, и тщательно смыт этим же буфером. Через колонку было пропущено 200 мл линейного градиента 0,05-0,5 М NaCl в буфере. Были объединены активные фракции, имеющие высокую активность изоцитратлиазы, сконцентрированы и диализированы буфером [206,207]. Также для разделения белковых фракций и их изоформ используют ионообменную хроматографию на