Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы

• Автор: Пятакова, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

Цель и задачи исследования

Обзор литературы

Глава 1. Растворимая гуанилатциклаза

1. Основные свойства растворимой гуанилатциклазы

2. Гетеродимерная структура растворимой гуанилатциклазы

3. Функциональные характеристики субъединиц фермента

- ]Ч-концевой регуляторный домен

- Центральный днмсризационный домен

- С-каталитический домен

4. Механизм каталитической активности растворимой гуанилатциклазы 18 Глава 2. Эндогенный оксид азота - активатор растворимой гуанилатциклазы
1. Образование эндогенного оксида азота
2. Активация фермента оксидом азота
3. Антигипертензивное действие оксида азота
4. Антиагрегантное действие оксида азота
5. Роль растворимой гуанилатциклазы в агрегации тромбоцитов
Материалы и методы исследований
1. Использованные реактивы и материалы
2. Объект исследования
3. Выделение тромбоцитов из крови человека
4. Получение препарата растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов 32 человека
5. Получение препарата растворимой гуанилатциклазы легких крысы
6. Определение концентрации белка
7. Определение активности гуанилатциклазы
8. Определение количества цГМФ

9. Проведение агрегации тромбоцитов
10. Статистическая обработка результатов
Результаты исследований и их обсуждение
Глава 1. Новые доноры оксида азота (N0) ) - активаторы гуанилатциклазы и 39 ингибиторы агрегации тромбоцитов.
1. Производные 1-нитроииразола
2. Производные бензотетразин-1,3-диоксида
3. Бензодифуроксан
4. Производные фуроксана, конденсированные с пиридазин-ди-1Ч- 63 оксидным циклом
Глава 2. Новые ингибиторы 1ЧО-зависимой активации растворимой
гуанилатциклазы
1. Карнозин - эндогенный дипептид
2. Амброксол (1а$о1уап) - муколитический препарат
3. Артемизинин - антималирийный препарат
Заключение
Выводы
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Эндогенный оксид азота (N0), оказавшийся эндотелиальным фактором релаксации (ЭДФР), является одним из основных сосудорасширяющих факторов. В 1998 г. американским ученым Роберту Ферчготту, Луису Игнарро и Фериду Мураду за открытие роли оксида азота, как сигнальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине.
Эндогенный N0 образуется из Ь-аргинина за счет окисления азота аминогруппы гуанидинового фрагмента под действием Ь-арпшин-МО-синтазы [1]. Он участвует во многих жизненно-важных процессах [2, 3], является мощным фактором гемостаза. Оксид азота ингибирует агрегацию тромбоцитов [4] и рассматривается в настоящее время как эндогенный вазодилататор [5]. Основным внутриклеточным рецептором N0 является растворимая гуанилатциклаза (гуанозин-5-трифосфатлиаза (циклизующая) ЕС.4.6.1.2.).
Фермент катализирует биосинтез циклического 3’,5’-гуанозинмонофосфата (цГМФ) из гуанозин-5-трифосфата (ГТФ). Циклический ГМФ является вторичным посредником, мощным регулятором метаболизма клетки, в значительной степени определяющим ее функции. Биологические эффекты цГМФ опосредуются тремя основными типами внутриклеточных эффекторов: цГМФ-зависимыми протеинкиназами [6], регулируемыми цГМФ - ионными каналами и фосфодиэстеразой [7]. Антиагрегантные свойства и сосудорасширяющее действие оксида азота связаны с активацией растворимой гуанилатциклазы и накоплением цГМФ [8]. Гидролиз цГМФ осуществляет фосфодиэстераза [7]. Однако, основным ферментом обмена цГМФ является гуанилатциклаза, и за накопление цГМФ в клетках отвечает именно этот фермент.
Гуанилатциклаза существует в двух формах: мембраносвязанная и растворимая. Эти формы представляют собой не только разные белки, но и ферменты с различными механизмами регуляции [9]. Мембраносвязанная гуанилатциклаза - это мономер,

Смешивали 15 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) с 285 мл дистиллированной воды. Таким образом получали 300 мл промывочного буфера. Данный буфер использовали для промывания планшета и приготовления рабочего раствора коныогата.
2. приготовление рабочего буфера для анализа.
Смешивали 5 мл концентрата буфера для анализа с 45 мл дистиллированной воды. Таким образом, получали 50 мл рабочего раствора буфера для анализа. Данный буфер применялся для разведения опытных проб и проб калибровочной кривой.
3. приготовление раствора антител.
Для приготовления рабочего раствора антител к 2,75 мл рабочего раствора буфера для анализа добавляли 25 мкл детергента Т¥Іп-20 и тщательно перемешивали. Далее добавляли 200 мкл концентрата антител.
4. приготовление раствора конъюгата.
Для приготовления рабочего раствора конъюгата к 5 мл промывочного буфера добавляли 0,5 мл концентрата конъюгата.
5. приготовление раствора хромогена.
1,25 мл тетраметилбензидина смешивали с 5 мл субстратного раствора.
Характеристика набора:
-диапазон измеряемого содержания цГМФ в пробах составлял 0,5 - 30 пмоль/мл;
-чувствительность набора - минимальное содержание цГМФ, определяемое с помощью набора для ИФА, составляла не более 1 пмоль/мл;
-воспроизводимость результатов: коэффициент вариации результатов измерения содержания цГМФ в образцах, не превышал 8%.
Проведение анализа:
полученный после центрифугирования проб супернатант разводили рабочим буфером для анализа в необходимое число раз (величина разведения — стандарт,