Влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование белка 14-3-3ζ, на его структуру и некоторые свойства

• Автор: Случанко, Николай Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Семейство белков 14

История исследования и номенклатура

Изоформы и филогения представителей семейства 14

Распределение белков 14-3-3 в тканях человека

Структурная организация 14

Механизмы взаимодействия 14-3-3 с белками-мишенями. Последовательности, узнаваемые 14-3-3

Функционирование белков 14

Различные способы регуляции функционирования белков 14
I). ГРУППА ТАУ БЕЛКОВ
Изоформенный состав и структура тау белков. Взаимодействие тау с микротрубочками
Функционирование и регуляция тау белков
Взаимосвязь тау белков с представителями семейства 14
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ:
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Трансформация клеток Е.соц и препаративная экспрессия белков
2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ 14-3-3 МЕТОДОМ кругового дихроизма
4. Флуоресцентные методы исследования
4.1. Измерение собственной флуоресценции 14-3-3?
4.2. Тушение флуоресценции 14-3-3( иодид-ионами, акриламидом и ионами цезия
4.3. Исследование гидрофобных свойств 14-3-37, с помощью флуоресцентного зонда бис-АНС
5. Исследование гидродинамических свойств и олигомерного состояния 14
5.1. Метод аналитической гель-фильтрации
5.2. Метод аналитического ультрацентрифугирования
5.3. Химическое «сшивание» изолированных препаратов 14-3-3 диметилсуберимидатом
6. Исследование термостабильности 14
6.1. Зависимость собственной флуоресценции 14-3-3 от температуры
6.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия 14
7. Ограниченный протеолиз 14
8. Фосфорилированиетау белка под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы
9. Исследование взаимодействия 14-3-3 с тау белком
9.1. Метод нативного электрофореза
9.2. Химическое «сшивание» 14-3-3 с тау белком при помощи глутарового альдегида
9.3. Метод гель-фильтрации
10. Другие аналитические методы
10.1. Спектрофотометрическое определение концентрации белка
10.2. БОБ-электрофорез по методу Лэммли
10.3. Градиентный БОЗ-электрофорез
10.4. Электрофорез белков в нативных условиях по методу Шауба-Пэрри
10.5. Электрофорез белков в нативных условиях по методу Шагера-фон Ягова
10.6. Авторадиография
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение мутантных форм 14-3-3 сзаменами, имитирующими структурные изменения, происходящие при фосфорилировании
1.1. Дизайн фосфоимитирующих мутантных форм 14-3-37,
1.2. Экспрессия, выделение и очистка исследуемых 14-3-3?
2. Влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на его структуру и свойства
2.1. Исследование вторичной структуры 14-3-3 методом кругового дихроизма

2.2. Исследование структуры 14-3-3 с помощью флуоресцентных методов
2.2.1. Собственная триптофановая флуоресценция 14
2.2.2. Тушениетриптофановой флуоресценции 14-3-3 иодид-ионами, ионами цезия и акриламидом
2.2.3. Исследование гидрофобных свойств 14-3-3 с помощью гидрофобного зонда бис-АНС. Анализ FRET с остатков триптофана на связанный бис-АНС
2.3. Исследование олигомерного состояний и гидродинамических свойств 14
2.3.1. Электрофорез 14-З-ЗТ в нативных условиях
2.3.2. Гель-фильтрация 14-3-3Ç
2.3.3. Аналитическое ультрацентрифугирование 14-3-3Ç
2.4. Исследование устойчивости 14-3-3 к повышенной температуре и действию протеаз
2.4.1. Использование метода флуоресценции для изучения термостабильносги 14
2.4.2. Исследование структуры 14-3-3 методом ограниченного протеолиза
3. Исследование взаимодействия 14-3-3 с тау белком человека
3.1. Получение рекомбинантной короткой изоформы may белка
3.2. Фосфорилирование may белка под действием ПНА
3.3. Влияние фосфорилирования may белка на его взаимодействие с .14
3.3.1. Исследование взаимодействия 14-3-3 с may белком методом нативного электрофореза
3.3.2. Исследование взаимодействия may с 14-3-3 методом аналитической гель-фильтрации
3.3.3. Химическое «сшивание» 14-3-3 с may белком под действием глутарового альдегида
3.4. Определение участков тоу белка, вовлеченных во взаимодействие с 14
3.4.1. Создание «аланиновых» мутантов may белка человека
3.4.2. Фосфорилирование «аланиновых» мутантов may белка под действием ПКА
3.4.3. Исследование взаимодействия 14-3-3 с фосфорилированными «аланиновыми» мутантами may белка методом нативного электрофореза
3.4.4. Химическое «сшивание» 14-3-3 с тоу белком или его фосфорилированными «аланиновыми» мутантами.
3.4.5. Метод аналитической гель-фильтрации
3.5. Влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-32 на его взаимодействие с фосфорилированным may белком
3.5.1. Метод химического «сшивания» глутаровым альдегидом
3.5.2. Метод нативного электрофореза
3.6. Предполагаемая роль 14-3-3 в функционировании may белков
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АТФ аденозинтрифосфат
бис-АНС бис-1,8-анилинонафталинсульфонат
ГА глутаровый альдегид
дмс димехилсуберимидат
дтт дитиотрейтол
кд круговой дихроизм
кДНК кодирующая ДНК
мРНК матричная РНК
мэ 3-меркаптоэтанол
ПААГ полиакриламидный гель
ГЖА протеинкиназа А
ПСА персульфат аммония
ТЕМЕД Н,Щ4’,Ы’-тетраметияэтилендиамин
Трис Т рис-гидроксиметиламинометан
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
цАМФ циклический аденозинмонофосфат
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
ЯМР ядерный магнитный резонанс
AANAT арилалкиламин N-ацетилтрансфераза
HEPES М-2-гидрокснэтилштеразин-М'-2-этансульфоновая кислота
Hsp белок теплового шока (heat shock protein)
IPTG изопропилтио-Р-П-галактозид
МАРК митоген-активируемая протеинкиназа (mitogen-activated protein kinase)
МАРКАРК киназа, активируемая митоген-активируемой протеинкиназой (mitogen-activated protein kinase activated protein kinase)
МЕК киназа MAP и ERK киназ (Mitogen-activated protein kinase kinase, MAP kinase/ERK kinase)
NCLK нейрональная сйс2-подобная протеинкиназа
NES nuclear export sequence
NFTs нейрофибриллярные сплетения (neurofibrillar tangles)
NLS nuclear localization sequence
LB среда Луриа-Бертани
PHFs парно-скрученные филаменты (paired helical filaments)
РКА протеинкиназа A
РКС протеинкиназа С
PIPES пиперазин-М,ЬГ-бис-(2-этансульфоновая кислота)
SDS цодецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate)
TLCK N-тозил-Е-лизин гидрохлорид хлорметилкетона (N6-tosyl-L-lysine chloromcthyl ketone hydrochloride)
ГРСК N-тозил-Е-фенилаланин хлорметилкетон (Ng-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)
WT белок дикого типа (wild type)

Рис. 12. Схема, демонстрирующая расположение may белка на поверхности микротрубочки (18).
Размеры may белка преувеличены по сравнению с размерами микротрубочки для наглядности. Повторы тубулин-связывающего домена may белка изображены красными кубиками, остальная часть структуры may, в том числе выступающий с поверхности микротрубочки кислый N-конец, отмечены оранжевым цветом.
Тау белки считаются классическим примером «внутренне-неупорядоченных белков» (IDPs, Intrinsically Disordered Proteins) (193) и в свободном состоянии не имеют выраженной вторичной и компактной третичной структуры (84, 125, 128). В этой связи, на данный момент в литературе отсутствует кристаллическая структура may белков, однако определенный успех был достигнут при исследовании структуры may методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (125). На рис. 13 представлена модель структуры may в растворе, полученная с помощью этого метода. Согласно данной модели, may белки в растворе имеют структуру, близкую к расплавленной глобуле, и в свободном состоянии не обладают какими-либо упорядоченными элементами вторичной структуры (42, 104, 165). При этом известно, например, что связывание may белков, как и любых представителей IDPs, с другими белками или их гомоолигомеризация может приводить к стабилизации и хотя бы