Изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке простаты

• Автор: Лисицкая, Ксения Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 146 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Введение
1. Исследования полиморфизма некоторых белков человека, регулирующих пролиферацию, апоптоз и клеточную подвижность, и отдельные биомедицинские аспекты изучения рака простаты (обзор литературы)
1.1. Общие характеристики белков, регулирующих клеточную пролиферацию, диф-ференцировку и рост; роль их полиморфизма при раке предстательной железы
1.1.1. Некоторые биомедицинские аспекты изучения проблем рака предстательной железы в постгеномную эру

1.1.2. Белки системы гормона роста и инсулиноподобного фактора роста-

1.1.3. Некоторые регуляторные белки, участвующие в контроле за апоптозом

1.1.4. Полиморфизм некоторых актин-связывающих белков при раке предстательной железы

1.2. Клеточные модели в биохимических исследованиях рака предстательной железы..

1.3. Протеомные технологии в изучении рака предстательной железы

1.4. Использование некоторых постгеномных технологий в исследовании роли однонуклеотидных замен в патогенезе рака предстательной железы
2. Материалы и методы
2.1. Биологические материалы и реактивы
2.1.1. Клеточные культуры человека
2.1.2. Образцы ткани простаты человека, цельной крови и сыворотки крови
2.1.3. Реактивы
2.2. Методы выращивания клеточных культур и методики определения пролиферативной активности
2.3. Иммуноферментный анализ
2.4. Протеомные методы исследования
2.4.1. Подготовка проб
2.4.2. Фракционирование белков двумерным электрофорезом по О'Фарреллу
2.4.2.1. Изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле с градиентом pH, миро-ванном амфолинами

2А.2.2. БЭБ-электрофорез в пластинах полиакриламидного геля
2.4.3. Детекция белков на гелевых пластинах. Дениситометрия двумерных электрофо-реграмм. Компьютерный анализ результатов. Хранение гелевых пластин
2.4.4. Масс-спектрометрическая идентификация белков
2.5. Методы получения ДНК и формирование ДНК-коллекций
2.6. Методы исследования ДНК-полиморфизмов
2.6.1. Простая ПЦР и рестрикционный анализ
2.6.2. Метод дискриминации аллелей с помощью ПЦР в реальном времени (ЯТ-РСК)..
2.7. Статистическая обработка результатов
3. Результаты и обсуждение
3.1. Изучение биологической активности отдельных регуляторных белков в модельных клеточных биотест-системах
3.2. Определение концентрации ЮР-1 и некоторых регуляторных белков в сыворотке крови пациентов с раком предстательной железы (иммуноферментный анализ)
3.3. Сравнительное протеомное изучение белков в культивируемых клетках рака (РС-
3) и доброкачественной гиперплазии простаты (ВРН-1)
3.4. Исследование регуляторного белка Цр1 у больных злокачественными и доброкачественными опухолями предстательной железы
3.4.1. Идентификация двух изоформ белка Ц|-1 в биопсийных образцах тканей рака предстательной железы
3.4.2. Иммуноферментное определение белка 19]-1 в сыворотке крови у больных с раком и гиперплазией предстательной железы
3.5. Изучение однонуклеотидного полиморфизма восьми генов ((1НК, ЮРВРЗ, КЗР111,
I 12.81, М8ТЫ, РМИ1, АЫХА2, ТАаЩ у этнических русских и у пациентов с раком предстательной железы
3.5.1. Изучение полиморфизма 458А>в (щ1805086, Ьуз153А^) в гене МБТЫ
3.5.2. Изучение ассоциаций полиморфных вариантов в генах, относящихся к системе гормона роста и инсулиноподобного фактора роста-1, с раком предстательной железы
3.5.3. Изучение ассоциаций полиморфных вариантов в генах, кодирующих синтез ак-тин-связывающих белков, с раком предстательной железы
4. Заключение
5. Выводы
6. Список цитированной литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДЭ двумерная электрофореграмма
АА акриламид
а.о. аминокислотные остатки в белках
АСБ актин-связывающие белки
АТФ аденозинтрифосфат
ДГПЖ доброкачественная гиперплазия предстательной железы
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
(к)Да (кило)дальтон
МБА метиленбисакриламид
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
НЭ нейроэндокринный эпителий предстательной железы
ПААГ полиакриламидный гель
ПЖ предстательная железа (человека)
ПИН простатическая интраэпителиальная неоплазия
ПСА простатспецифический антиген
ПЦР полимеразная цепная реакция
РНК рибонуклеиновая кислота
РПЖ рак предстательной железы
ТЕМЕД Ы,И,И’,И’-тетраметилэтилендиамин
ЭТС эмбриональная телячья сыворотка
BSA бычий сывороточный альбумин
DU-145 клеточная линия рака предстательной железы
ESI электроспрейная ионизация
GH гормон роста
IEF изоэлектрофокусирование
IEF-PAGE двумерный электрофорез с использованием изоэлектрофокуси-
рования в градиенте pH, созданном амфолитами IPG-PAGE двумерный электрофорез с использованием изоэлектрофокуси-
рования в иммобилизованном градиенте pH LNCaP клеточная линия рака предстательной железы
MALDI-TOF опосредованная матрицей (времяпролетная) лазерная десорбция/
ионизация
MS масс-спектрометрия
MS/MS тандемная масс-спектрометрия
NCBI национальный центр биотехнологической информации в США

Первым идентифицированным белком данного семейства стал формин-1 мыши [Evangelista М. et al., 2003]. В структуре белка FMN1 человека, состоящего из 1419 а.о., выявлены как домен FH1, так и FH2 [запись Q68DA7 в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot]. Этот белок кодируется геном FMN1, состоящим из 24 экзонов и картированным в локусе 15ql3.3 [Katoh М., Katoh М., 2004]. В гене FMN1 обнаружено более 2300 SNP's, из которых 28 располагаются в кодирующих областях [gene ID:342184, NCBI SNP]. Известно, что при экспрессии гена FMN1 в результате альтернативного сплайсинга образуется б трансриптов, кодирующих 4 различные изоформы белка [записи Q68DA71-4 в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot], Изоформы 1 (содержит экзоны 1-18) и 2 (экзоны lb and 3-18) образуются по механизму альтернативного сплайсинга за счет использования альтернативного промотора.
Формины активно изучаются не только как важнейшие регуляторы клеточной подвижности, но и как участники канцерогенеза. В частности, была выявлена продукция мРНК Formin-like 2 (FMNL2) белка в нормальных тканях (в центральной и периферической нервной системе, а также в эпителии) и при некоторых типах рака [Katoh М., Katoh М., 2003]. При этом Zhu X.L. с соавт. (2008) обнаружили повышенный синтез белка FMNL2 при метастатическом раке прямой кишки и предположили, что данный белок может найти применение в качестве маркера метастазирующего рака прямой кишки.
1.2. Клеточные модели в биохимических исследованиях рака предстательной железы.
Выраженная гетерогенность клеточного состава ПЖ создает комплекс проблем для изучения патогенеза РПЖ и поисков биомаркеров данного заболевания [Aikara М. et al., 1994]. По мнению многих авторов, использование культивируемых клеточных линий, моделирующих злокачественные и доброкачественные опухоли ПЖ, является перспективным подходом для решения различных биомедициских проблем, связанных с РПЖ [Bosland М.С. et al., 1996; Bladou F. et al., 1997; Horrocks C. et al., 2003; Fizazi K., Navone N.M., 2005; Alimirah F. et al., 2006; Heeg S. et al., 2006].
В целом, история культуральных моделей насчитывает уже более 90 лет [Пинаев Г.П., Богданова М.С., 2008]. Первые попытки успешного культивирования ткани простаты были предприняты еще в 1917 г. [по Harris С.С. et al., 1980]. Однако первичные культуры ткани ПЖ имели ограниченный период жизни, что делало их недостаточно удобными для биохимических исследований.
Начало периода бурного развития культуральных методик можно отнести ко второй половине 20 века. Важным достижением данного периода стало получение переви-