Роль внешнемембранных везикул в секреции бактериолитических ферментов Lysobacter sp.

• Автор: Васильева, Наталья Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
Внутриклеточные бактериолитические (автолитические)
ферменты бактерий
Внеклеточные бактериолитические ферменты бактерий
1.2 КЛЕТОЧНАЯ ОБОЛОЧКА БАКТЕРИЙ
Клеточная стенка грамположительных бактерий
Строение клеточной оболочки грамотрицательных
бактерий
1.3 ПЕПТИДОГЛИКАН - СУБСТРАТ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
Структура пептидогликана
Специфичность действия бактериолитических ферментов
1.4 СЕКРЕЦИЯ БЕЛКОВ У БАКТЕРИЙ
Одностадийные способы секреции
Двухстадийные способы секреции
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ И УСЛОВИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ
2.2 СУБКЛЕТОЧНОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ
2.3 ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ
2.4 ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЗИКУЛ
2.5 ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
2.6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЗИКУЛ
2.7 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
2.8 ИММУНОБЛОТТИНГ БЕЛКОВ
2.9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА
2.10 ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ 2-КЕТ0-3-ДЕ30КСИ-0-МАННООКТОНАТА
2.11 ЭКСТРАКЦИЯ ТЕЙХОЕВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК S. AUREUS 209Р
2.12 АНАЛИЗ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ АКТИВНОСТЕЙ
Определение общей бактериологической активности
Определение протеазной активности
Определение активности циклической фосфодиэстеразы
Определение активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы
Определение активности N-ацетилмурамоилL-ал анинамидазы
Определение мурамидазной активности
2.13 ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА Л5 LYSOBACTER SP. XL1
Получение белков культуральной жидкости
Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе и СМсефадексе
Гельфильтрация на Superdex
Ионообменная хроматография на monoS
2.14 ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТА Л5 LYSOBACTER SP. XL1
Определение N-концевой аминокислотной последовательности
фермента Л5
Определение оптимального значения pH для реакции лизиса
клеток S. aureus 209Р ферментом Л5
Определение оптимального значения концентрации буфера для
реакции лизиса клеток S. aureus 209Р ферментом Л5
Определение оптимальной температуры реакции лизиса
клеток S. aureus 209Р ферментом Л5
Определение температуры полуинактивации фермента JI5
Определение действия ингибиторов
Определение спектра литического действия фермента JI5
Определение действия фермента JI5 на клеточные стенки
некоторых бактерий
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 НОВЫЙ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЙ ФЕРМЕНТ
LYSOBACTER SP. XL1
Выделение бактериолитического фермента Л5
Определение некоторых свойств фермента Л5
Определение спектра литического действия фермента Л5
3.2 ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА СЕКРЕЦИИ
БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ LYSOBACTER SP
Обнаружение и характеристика внеклеточных везикул
Lysobacter sp
Обнаружение литической активности в везикулах
Lysobacter sp
Секреция бактериолитических протеаз Л1 и Л5
Lysobacter sp. XL1
Биологическая роль способа секреции бактериолитических
ферментов посредством везикул
ГЛАВА 4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Для ультрагонких срезов фиксацию исследуемых образцов колоний клеток на агаризованных средах осуществляли в парах глутарового альдегида с последующей дополнительной фиксацией в парах четырехокиси осмия (ОяОД. Этот подход обеспечивает минимальные потери секретируемых везикул при препарировании. Материал заключали в 2% агар и после обезвоживания этиловым спиртом возрастающей концентрации заключали в эпоксидную смолу Ероп 812. Ультратонкие срезы монтировали на опорные сеточки, контрастировали в течение 30 мин в 3% растворе уранилацетата в 70% спирте и дополнительно контрастировали в течение 4 мин цитратом свинца (Reynolds, 1963). Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100B (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кв.
2.6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЗИКУЛ
Для определения литического действия везикул использовали живые клетки грамотрицательных микроорганизмов (Pseudomonas fluorescens 1472, Pseudomonas putida, Proteus vidgaris H-19, Proteus mirabilis N2, Escherichia coli K12, Erwinia caratovora B15, Alcaligenes faecalis), грамположительных микроорганизмов (В. subtilis W23, Bacillus cereus 217, Micrococcus roseus В1236, Micrococcus luteus В1819, Corynebacterium xerosis, S. aureus 209P, Rathayibacter tritici), дрожжей (Torulaspora delbrueckii BKM Y-706, Candida utilis BKM Y-74, Candida boidinii BKM Y-34, Candida guilliermondii BKM Y-41, Saccharomyces cerevisiae M660, Pseudozyma fusiformata) и мицелиальных грибов (Sclerotinium sclerotiorum, Fusarium sporotrichiella). Ela подросший газон клеток-мишеней наносили 25 мкл препарата везикул Lysobacter sp. XL1, что соответствовало 24 мкг суммарного белка. Чашки продолжали инкубировать при 29°С до появления зон лизиса.