Регуляция экспрессии гена THIC Arabidopsis thaliana с помощью тиаминпирофосфатного рибосвича

• Автор: Маланин, Сергей Юрьевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 113 с. : ил.

Содержание
Список сокращений
Введение
Обзор литературы
1. Рибосвичи - риборегуляторы генной экспрессии
2. Открытие и методы изучения рибосвичей
3. Классы рибосвичей
4. Механизмы контроля экспрессии генов рибосвичами
5. Практическое применение рибосвичей
Заключение по обзору литературы
Экспериментальная часть
Материалы и методы исследования
Результаты и обсуждение
1. Регуляция экспрессии гена THIC происходит с помощью
ТПФ рибосвича
2. Нонсенс-опосредованное разрушение мРНК (NMD) участвует
в деградации 1HIC-UI изоформы
3. Поиск новых классов рибосвичей в геноме растений арабидопсиса
с помощью ДНК-тайлинг чипов
Выводы
Список литературы

Список сокращений
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
гДНК - геномная дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты
кДНК — копийная ДНК
н.п. - нуклеотидных пар
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-ПЦР
ПСК - преждевременный стоп кодон
ГТЦР - полимеразная цепная реакция
РНК — рибонуклеиновая кислота
ТПФ - тиаминпирофосфат
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
СТАВ - цетилтриметиламмониумбромид
DMSO - диметилсульфоксид
SAM - S-аденозилметионин
SDS - додецил сульфат натрия
ВВЕДЕНИЕ
Регуляция экспрессии генов является неотъемлемой частью существования любого живого организма. При постоянно изменяющихся условиях внешней среды клетка должна своевременно реагировать специфичными изменениями метаболизма для быстрого и адекватного приспособления. Одним из механизмов подобного контроля является регуляция экспрессии генов, происходящая на всех этапах транскрипции, процессинга и трансляции мРНК. В ходе эволюции возникли разнообразные формы регуляции, где главными “рабочими молекулами” являются белки. В* то же время, обнаружены и такие способы контроля- работы генов, которые не требуют участия белков, отражающие, возможно, наиболее древние методы регуляции. Среди них можно выделить особый класс рибонуклеиновых регуляторов, названных рибосвичами (riboswitch).
Первоначально обнаруженные в бактериях, рибосвичи представляют собой небольшие участки молекул. мРНК, находящиеся, как правило,, в 5’ некодирующей области и способные с высокой селективностью связывать определенные метаболиты и посредством такого связывания- влиять на транскрипцию или- трансляцию этих мРНК путём образования регуляторных вторичных структур (Winkler, Breaker, 2005). Рибосвич состоит из двух функционально различных доменов: отвечающая за связывание аптамеровая часть является наиболее консервативной областью и, связывая определенный метаболит, вызывает конформационные изменения во втором домене -экспрессионной платформе, что приводит к образованию терминаторов/антитерминаторов транскрипции или к блокированию последовательности Шайн-Дальгарно. Таким образом, происходит регуляция транскрипции или трансляции мРНК, содержащих рибосвичи, в зависимости от концентрации лиганда.

Интересно биологическое распространение рибосвичей, которые используют или терминацию транскрипции или блокирование инициации трансляции. Это распространение среди бактерий крайне неравномерно. Грамположительные бактерии используют, как правило, для регуляции экспрессии генов терминацию транскрипции, тогда как грамотрицательные — блокирование последовательности Шайн-Дальгарно* (Vitreschak et al., 2004). Например, рибофлавиновый рибосвич- у грамположительных бактерий в примерно 83% случаях использует терминацию транскрипции в регуляции, а у грамотрицательных в 80% случаях - контроль трансляции (Vitreschak et al., 2002). Эта корреляция в регуляции может быть объяснена горизонтальным переносом генов и целых оперонов.вместе с регуляторными элементами внутри таксономической группы. Не учитывая общую высокую консервативность-рибосвичей, многие их них имеют таксономически специфичные нуклеотидные последовательности и> вторичные структуры (Vitreschak et al., 2002; Vitreschak et al., 2003).
С помощью биоинформатического анализа была- идентифицирована небольшая; группа рибосвичей, которые, возможно, регулируют синтез антисмысловых РНК. Например, оперон ubiG-yrbAB {Clostridium acetobutylicum). в 5’ нетранслируемой области содержит Т-бокс регуляторную РНК, отвечающее на количество тРНКЦис (Rodionov et ah, 2004). В этом опероне также был найден РНК мотив, соответствующий SAM рибосвичу, который располагается непосредственно после оперона и транскрибируется в антисенс направлении. Это расположение рибосвича- предполагает, что при увеличении концентрации S-аденозилметионина в клетке, происходит накопление антисенс транскрипта оперона ubiG-yrbAB. Однако экспериментального доказательства этого предположения ещё не получено.
Рибосвичи выполняют также функцию регуляторов процессинга мРНК.
Глюкозамин-6-фосафтный рибосвич регулирует экспрессию гена glmS путем
расщепления его мРНК. Этот процесс происходит при связывании рибосвичем