Связывание субстратов с транскетолазой Saccharomyces Cerevisiae и их каталитические превращения

• Автор: Юршев, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие свойства транскетолазы
1.2. Структура транскетолазы

1.3. Сравнение структур апо- и холотранскетолазы
1.4. Кофакторы транскетолазы
1.4.1. Взаимодействие апотранскетолазы с коферментом
1.5. Структура субстратного канала
1.5.1. Интермедиат транс кето л а зной реакции -дигидроксиэтилтиаминд иф осфат
1.6. Механизм транскетолазной реакции
1.7. Оптические характеристики транскетолазы
1.7.1. Изменение оптических характеристик транскетолазы при связывании субстратов
1.8. Влияние двухвалентных катионов, Са2+ и Mg2+, на конформацию и стабильность транскетолазы
1.9. Функциональная неэквивалентность активных центров транскетолазы
1.9.1. Неидентичность активных центров при химической модификации аминокислотных остатков
1.9.2. Неэквивалентность активных центров по связыванию кофермента
1.10. Заключение по обзору литературы
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.2. Объект исследования

2.3. Методы исследований
2.3.1. Определение белка
2.3.2. Количественное определение тиаминдифосфата и окситиаминдифосфата
2.4. Определение активности транскетолазы
2.4.1. В двусубстратной реакции
2.4.2 В односубстратной реакции
2.5. Реконструкция холотранскетолазы из апо- и кофермента
2.6. Получение полухолотранскетолазы
2.7. Получение полухолотранскетолазы
2.8. Освобождение раствора холотранскетолазы от свободных двухвалентных катионов
2.9. Определение концентрации ксилулозо-5-фосфата и рибозо-5-фосфата
2.10. Определение Кт для субстратов транскетолазы
2.11. Постановка экспериментов по ингибированию транскетолазы феррицианидом
2.12. Статистическая обработка результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Влияние Са2+ на активность холотранскетолазы
3.2. Влияние Са2+на кинетические характеристики транскетолазной реакции
3.2.1. Влияние Са2+на связывание и превращение субстрата-донора, ксилулозо-5-фосфата
3.2.2. Влияние Са2+ на связывание и превращение субстрата-акцептора,
рибозо-5-фосфата
3.3. Кинетические характеристики ТК при использовании Mg2+
в качестве кофактора
3.3.1. Связывание субстрата-донора, ксилулозо-5-фосфата, с транскетолазой

и его каталитические превращения в присутствии М&2+
3.3.2. Кинетические характеристики связывания с ТК и превращения
субстрата-акцептора, рибозо-5-фосфата, в присутствии М§2+
3.4. Неэквивалентность активных центров ТК по отношению к
ингибирующему действию феррицианида
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

стало подвергаться сомнению, так как в активном центре фермента остатка триптофана, расположенного в достаточной близости от связанного кофермента, обнаружено не было [Schneider G., Lindqvist Y., 1998]. Роль триптофана в образовании комплекса с переносом заряда стали приписывать Phe445, который находится в активном центре холоТК в непосредственной близости от аминопиримидинового кольца ТДФ. Однако, мутантная форма ТК, у которой фенилаланин был заменен на изолейцин, не потеряла свою каталитическую активность. Сохранялась и индуцированная полоса поглощения, но интенсивность ее уменьшилась в 5 раз [Meshalkina, L., Wikner, C., Nillson, U., Lindqvist, Y., Schneider, G., 1996].
Как уже упоминалось ранее, встраивание ТДФ в активный центр ТК, сопровождающееся конформационными перестройками молекулы белка, приводит к стабилизации двух петель, расположенных хаотично в апоТК и строго организованных в холоферменте. В результате происходит сближение остатка Тгр391 одной петли и остатка Туг370 - другой, причем их ароматические кольца оказываются параллельными друг другу. На основании этого1 факта было высказано предположение, что индуцированные тиаминдифосфатом изменения в спектре холоТК обусловлены стэкинг взаимодействием ароматических колец указанных аминокислотных остатков. Но это предположение не было экспериментально доказано.
Согласно современным представлениям, причиной возникновения новой полосы в спектрах поглощения и кругового дихроизма, при связывании тиаминдифосфата с апотранскетолазой и образовании каталитически активного холофермента, является изменение оптических свойств самого кофермента при попадании1 его в гидрофобное окружение активного центра фермента. При этом, аминоформа аминопиримидинового кольца ТДФ превращается в имино-таутомерную форму, путем протонирования N1'-атома аминопиримидинового кольца ТДФ, которая