Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации

• Автор: Марков, Денис Игоревич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с.

Содержание

Список используемых обозначений

Введение

Обзор литературы

1. Структура и основные свойства миозина

2. Структура миозиновой головки

3. Легкие цепи миозина

4. Применение метода ДСК для исследования S

5. Новый подход к анализу необратимой тепловой денатурации мультидомен-

ных белков (по [Зубов, 2001] с изменениями)

6. Агрегация белков, вызванная их тепловой денатурацией

7. Малые белки теплового гаока
8. Взаимодействие малых белков теплового шока с миозином
Глава 1. Материалы и методы
1.1. Разглицеринизация миозина
1.2. Получение SI [Weeds, Taylor, 1975]
1.3. Определение концентрации белков
1.4. Определение АТРазной активности
1.5. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS
1.6. Исследование тепловой денатурации S1 методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)
1.7. Расчет и вычитание химической базовой линии в ДСК экспериментах
1.8. Исследование температурных зависимостей флуоресцентных свойств S1
1.9. Тепловая инактивация АТРазы S1 и миозина
1.10. Исследование агрегации S1 1методом регистрации светорассеяния
1.11. Метод динамического лазерного светорассеяния (DLS)
1.12. Аналитическое соосажденис
1.13. Расчетные процедуры

Глава 2. Результаты и их обсуждение
2.1. Исследование тепловой денатурации изоформ Э1 методом ДСК
2.2. Тепловые изменения собственной триптофановой флуоресценции изоформ Б1
2.3. Тепловая инактивация АТРазы
2.4. Тепловая агрегация изоформ 81 в условиях высокой ионной силы
2.5. Тепловая агрегация изоформ Б1 в условиях низкой ионной силы
2.6. Влияние малых белков теплового шока па индуцируемую нагреванием инактивацию АТРазы 81 и миозина
2.7. Влияние Нйр27-ЗВ на тепловую денатз'рацию Б
2.8. Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию Б!
2.9. Исследование комплексов, образуемых Няр27-ЗЕ) с в1 в процессе совместной
инкубации при 43 °С, методом аналитического соосаждения
Выводы
Литература

Список используемых обозначений
АКФ автокорреляционная функция
бис-ANS бис-1,8-анилинонафталинсульфонат
ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия
ДТНБ 5-5’-Дитио-бис-(2-нитробензойная кислота)
ДТТ дитиотрейтол
ЯМР ядерный магнитный резонанс
ADP аденозиндифосфат
AMP-PNP 5’-adenylyl-/3-7-imidodiphosphate (аналог АТР, у которого кислород
между 2-м и 3-м атомами фосфора заменен на NH-rpynny)
АТР аденозинтрифосфат
DLS dynamic light scattering (динамическое лазерное светорассеяние)
EDC 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (этилендиаминтетрауксусная кис-
лота)
GAPDH глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа
НС heavy chain of SI (тяжелая цепь Si)
Hepes М-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-№-(2-этансульфоновая кислота)
НММ heavy meromyosin (тяжелый меромиозин)
Hsp heat shock proteins (белки теплового шока)
sHsp small heat shock proteins (малые белки теплового шока)
Hsp27 малый белок теплового шока человека с молекулярной массой
27 кДа
Hsp27 wt малый белок теплового шока человека с молекулярной массой
27 кДа дикого типа
Hsp27-3D малый белок теплового шока человека с молекулярной массой
27 кДа с заменой остатков Scr-15, Ser-78 и Ser-82 на остатки Asp PMSP phenylmcthylsulfonyl fluoride (фенилметилсульфонил-фторид)
SI субфрагмент 1 миозина
SDS sodium dodecyl sulfate (додецилсульфат натрия)

в которых S1(A2) практически не был способен инициировать полимеризацию актина. В этих условиях мутант, лишенный последовательности Lys-3 - Lys-8, но содержащий вместо нее на N-конце 6-членный фрагмент с двумя остатками Arg, обладал способностью инициировать полимеризацию G-актина, хоть и несколько медленнее, чем белок, дикого типа. В то же время мутанты, лишенные не только участка Lys-3 - Lys-8, но и всего участка, содержащего (Pro-Ala) повторы- (А1а-14 - Рго-27), вели себя точно также как S1(A2) дикого типа. Более того, способность инициировать полимеризацию G-актина хорошо коррелировала с кинетическими параметрами актин-активируемой АТРазной активности в условиях низкой ионной силы (5 мМ КС1). Мутанты, лишенные обоих кластеров, Lys-3 -Lys-8 и А1а-14 - Рго-27, демонстрировали значения Км и Vmax, очень близкие к таковым для S1(A2), в случае же мутанта с заменой участка Lys-3 - Lys-8 на фрагмент с двумя остатками Arg значения этих параметров были промежуточными между Sl(Al) и Sl(A2) [Lowey et al, 2007]. Таким образом, за модуляцию АТРазной активности при взаимодействии S1 с актином и за способность индуцировать полимеризацию G-актина отвечают, по-видимому, одни и те же взаимодействия N-конца легкой цепи А1 с актином. Учитывая, что способность индуцировать полимеризацию актина связана со способностью стабилизировать димер G-актина, можно заключить, что А1 и моторный домен S1 действительно взаимодействуют с разными мономерами актина.
3.4. Взаимодействие N-концевого сегмента легкой цепи А1 с моторным доменом миозиновой головки
Относительно недавно было обнаружено еще одно интересное свойство N-концево-го сегмента легкой цепи А1 - это его способность взаимодействовать с глобулярным моторным доменом миозиновой головки. В одной из последних работ [Lowey et al., 2007] авторы пометили N-конец легкой цепи А1 кластером золота и декорировали актиновые филамепты препаратом S1, содержащим такую меченную легкую цепь. Затем методом электронной криомикроскопии определили положение кластера золота в таких филамен-тах. Компьютерный докинг структуры S1, полученной Райментом [Rayment et al., 1993а], в трехмерную реконструкцию таких декорированных филаментов показал, что N-конце-вой фрагмент А1 в комплексе Sl-F-актин локализован вблизи ЭНЗ-домена миозиновой головки (см. Рис. 2). Учитывая, что SH3-домены специфически узнают Рго-богатые лиганды, полученный результат свидетельствует в пользу того, что обогащенная пролином