Свойства и роль пирофосфат-зависимых 6-фосфофруктокиназ у аэробных метанотрофов и метилобактерий

• Автор: Розова, Ольга Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Список сокращений
АТФ-ФФК - АТФ-зависимая 6-фосфофрукгокиназа
ВЦМ - внугрицитоплазматические мембраны
ГАФ - глицеральдегид-3-фосфат
ГФС - 3-гексулозофосфатсинтаза
ГФИ - гексулозофосфатизомераза
ДОАФ - диоксиацетонфосфат
ДСН/БПБ - додецилсульфат натрия
ДХФИФ - 2,6-дихлорфенолиндофенол
ИПТГ - изопропил-Д-тиогалактозид
КДФГ - 2-кето-З-дезокси-б-фосфоглюконат
КоА - кофермент А
м.м. - молекулярная масса
МДГ - метанолдегидрогеназа
ММО/мММО/рММО - метанмонооксигеназа/ мембрансвязанная/ растворимая ОПР - оксипируватрсдуктаза
ПААГ - полиакриламидный гель
ГТГБ - полигидроксибутират
ПФК - пирофосфат-зависимая 6-фосфофруктокиназа
ПФДК - пируват-фосфатдикиназа
ПХХ/РОр - пирролохинолинхинон
РБФКО/РубисКО - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа
РМФ - рибулозомонофосфатный цикл ассимиляции формальдегида
РБФ- рибулозо-1,5-бисфосфат
РФИ - рибулозофосфатизомераза
РФЭ - рибулозофосфатэпимераза
Ру-5-Ф- рибулозо-5-фосфат
СБФ - седогептулозо-1,7-бисфосфат
С-7-Ф — седогептулозо-7-фосфат
ТГМП - тетрагидрометаноптерин
ТГФ - тетрагидрофолат
ТК - транскетолаза
ФА - формальдегид
ФАДГ — формальдегиддегидрогеназа
ФБА - фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза
ФБФ- фруктозо-1,6-бисфосфат
ФБФаза- фруктозо-1,6-бисфосфатаза
3-ФГІС — 3-фосфоглицериновая кислота
ФДГ - формиатдегидрогеназа
ФЕП - фосфоенолпируват
ФМС - феназинметосульфат
ФМСФ/РМБР- фенилметилсульфонилфторид
ФРК - фосфорибулокиназа
Фр-6-Ф - фруктозо-б-фосфат
ФФК — 6-фосфофруктокиназа
ФФн - неорганический пирофосфат
ФФн-аза - неорганическая пирофосфатаза
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ЭТЦ— электрон-транспортная цепь
(1НТФ - дезоксинуклеотидтрифосфаты
Нрр - ген мембрансвязанной пирофосфатазы
Н4МПТ- Ы10- метилентетрагидрометаноптерин
(Г-ФФ„-аза мембрансвязанная протонтранслоцирующая пирофосфатаза
Мг - молекулярный радиус
р/р - ген пирофосфат-зависимой 6-фосфофруктокиназы
Оглавление
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Пирофосфатзависимая б-фосфофруктокиназа
1.1. Свойства и метаболическая роль ПФК
1.2. Характеристика ПФК метилотрофных бактерий
1.3. Структурный анализ ПФК
1. 4. Классификация и филогенетический анализ ФФК
1.5. Фруктозо-1,6-бисфосф)атальдолаза
Глава 2. Характеристика аэробных метилотрофных бактерий
2.1. Энергетический метаболизм
2.2. Конструктивный метаболизм
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Материалы и методы исследования
3.1. Культивирование бактерий
3.2. Выделение геномной ДНК
3.3. Выделение плазмидной ДНК
3.4. Выделение РНК
3.5. Определение стартовой точки транскрипции методом удлинения праймера
3.6. ОТ-ПЦР анализ
3.7. Нозерн-блот анализ
3.8. Получение компетентных клеток и их трансформация
3.9. Клонирование и экспрессия геновр/р я/Ьа
3.10. Выделение рекомбинантных белков аффинной металлхелатной хроматографией
3.11. Измерение активности ПФК
3.12. Измерение активности ФБА
3.13. Определение субъединичного состава белков и молекулярной массы субъединиц
3.14. Электрофорез в градиенте пористости ПААГ
3.15. Определение нативной массы белка с помощью гель-фильтрации
3.16. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей

3.17. Аналитические методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 4. Характеристика рекомбинантных ПФК и ФБА Methylococcus capsulatus Bath
4.1. Клонирование гена р/р и очистка ПФК-ІТізб
4.2. Характеристика рекомбинантной ПФК
4.3. Изучение транскрипционной организации р/р и hpp генов
4.4. Клонирование гена fba и очистка ФБА-Шэб
4.5. Характеристика рекомбинантной ФБА
4.6. Изучение транскрипции гена fba
4.7. Филогенетический анализ ФБА
4.8. Роль ПФК и ФБА в метаболизме Methylococcus capsulatus Bath
Глава 5. Характеристика рекомбинантной ПФК Methylomicrohium alcaliphilum 20Z
5.1. Клонирование генаpfp и очистка ПФК-НІБб
5.2. Характеристика рекомбинантной ПФК
5.3. Роль ПФК в метаболизме Methylomicrohium alcaliphilum 20Z
Глава 6. Характеристика рекомбинантных ПФК Methylosinus trichosporium ОВЗЬ
и Methylobacierium nodulans ORS 2060
6.1. Клонирование генов pfp и очистка рекомбинантных ПФК
6.2. Характеристика рекомбинантных ПФК
6.3. Роль ПФК в метаболизме Methylosinus trichosporium ОВЗЬ и Methylobacterium nodulans ORS 2060
Глава 7. Филогенетический анализ ПФК метилотрофных бактерий
Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Таблица 4. Общая характеристика известных таксонов метаногрофных
Характеристики I и X типы II тип
Филум Gammaproteobacteria Alphaproteobacteria Verrucomicrobia
Семейство Methylococcace ае Methylocystaceae Вецеппскласеае Methylacidiphilaceae
Рода Methylobacter, Methylococcus, Methylocaldum, Methylohalobius, Methylomicrohium, Methylosoma, Methylomonas, Methylosarcina, Methylosphaera, Methylothermus, Crenothrix, Clono thrix, Methylovulum, Metylomarinum Methylosinus, Methylocystis, Methyloferula Ме(Ьу1осар$а, МеЖу1осе11а Methylacidiphilum
РМФ-путь +
Сериновый путь - + + +
РБФК/О иногда - - +
бММО +/- +/- +
рММО +/- +/- +/- +
Фиксация азота +/- +/- + на-
Тип ВЦМ Связки дисков перпендикулярно периферии клетки Мембранные стеки пара ллельно периферии клетки Мембранные везикулы параллельно длинной оси клеточной мембраны (МеШуЬсаряа) или выпячивания цитоплазматической мембраны (Ме1ку1осе11а)
Карбоксисомы или везикулы - . + ч-
Покоящиеся формы цисты или отсутствуют цисты или споры - цисты или споры нет
Г+Ц мол% 43-65 62-67
Факультативность - - варьирует между видами