Биохимические и генетические аспекты регуляции пролактином овариальной функции коров на молекулярном и клеточном уровнях

• Автор: Лебедева, Ирина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.02.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 371 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гормональный контроль фолликулогенеза у млекопитающих

1.1.1. Динамика роста и созревания овариальных фолликулов

1.1.2. Атрезия как процесс физиологической дегенерации фолли- 24 кулов

1.1.3. Центральная роль гонадотропных гормонов в регуляции 29 фолликулогенеза

1.1.4. Регуляторное влияние пролактина на функциональное со- 35 стояние клеточных элементов антральных фолликулов
1.1.5. Участие метаболических гормонов в модуляции процессов 41 развития и атрезии фолликулов
1.2. Интрафолликулярная система регуляции созревания ооцитов в 48 яичниках млекопитающих
1.2.1. Ядерные и цитоплазматические преобразования в созре- 49 вающем ооците
1.2.2. Молекулярные факторы, участвующие в регуляции мейоза 53 на уровне ооцита
1.2.3. Сигнальные пути в клетках кумулюса/гранулезы, связанные 60 с модуляцией мейоза ооцитов
1.2.4. Роль гипофизарных гормонов в контроле созревания ооци- 66 тов
1.3. Структурно-функциональные свойства рецептора пролактина
1.3.1. Характеристика лактогенного рецептора как члена суперсе- 74 мейства цитокиновых рецепторов
1.3.2. Множественные изоформы рецептора пролактина

1.3.3. Внутриклеточные сигнальные каскады, сопряженные с ре- 80 цептором пролактина
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы
2.1.1. Объект исследования
2.1.2. Реактивы и оборудование
2.2. Методы исследований
2.2.1. Оценка репродуктивного состояния животных и морфоло- 90 гии структурных элементов яичников
2.2.2. Выделение и оценка материала для исследований
2.2.2.1. Получение фолликулярной жидкости и сыворотки кро- 91 ви коров
22.2.2. Выделение и оценка качества популяции клеток грану
лезы
2.2.2.3. Выделение и морфологическая характеристика ооцит- 92 кумулюсных комплексов и изоляция ооцитов
2.2.2.4. Выделение желтого тела
2.2.3. Радиоиммунологическое определение концентрации про- 93 лактина в биологических жидкостях
2.2.4. Радиорецепторный анализ
2.2.4.1. Подготовка клеток гранулезы к радиорецепторному 94 анализу
2.2.4.2. Проведение анализов связывания меченого пролактина 94 с клетками гранулезы
2.2.4.3. Характеристика специфического связывания пролакти- 96 на с гранулезными клетками
2.2.5. Культивирование клеток гранулезы из антральных фолли- 97 кулов
2.2.5.1. Получение монослойной культуры клеток

2.2.5.2. Бессывороточная инкубация клеток
2.2.5.3. Суспензионное культивирование клеток из антральных 99 фолликулов на ранней стадии атрезии
2.2.6. Оценка интенсивности синтеза ДНК в культуре клеток гра- 100 нулезы
2.2.7. Определение концентрации половых стероидных гормонов 101 в культуральных средах
2.2.8. Анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформ 102 рецептора пролактина
2.2.8.1. Подготовка клеточного материала для выделения то- 102 тальной РНК
2.2.8.2. Выделение тотальной РНК из овариальных клеток
2.2.8.3. Синтез первой цепи комплементарной ДНК
2.2.8.4. Метод полимеразной цепной реакции
2.2.8.5. Метод конкурентной полимеразной цепной реакции
2.2.8.6. Полуколичественный анализ продуктов ОТ-ПЦР
2.2.9. Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов и 107 денудированных ооцитов
2.2.10. Морфофункциональная характеристика клеток кумулюса
2.2.11. Определение содержания депонированного кальция в 108 ооцитах флуоресцентным методом
2.2.12. Иммуноферментный анализ внутриклеточного уровня 109 цАМФ
2.2.13. Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов
2.2.14. Цитогенетический анализ ооцитов, зигот и эмбрионов
2.2.15. Статистическая обработка экспериментальных данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Идентификация физиологических факторов, детерминирующих
интрафолликулярное содержание пролактина у коров

тролируют локальную продукцию и рецепцию различных интрафолликуляр-ных факторов, которые, в свою очередь, опосредуют и модулируют многие эффекты гонадотропных гормонов, что в конечном итоге и определяет судьбу фолликула: овуляция или атрезия.
1.1.4. Регуляторное влияние пролактина на функциональное состояние клеточных элементов антральных фолликулов
К настоящему времени установлено, что не только ФСГ и ЛГ, но и другие гормоны гипофиза, в первую очередь ПРЛ, участвуют в регуляции активности яичников у млекопитающих. Несмотря на высокую полифункциональность пролактина, которого также относят к метаболическим и иммуномодулирующим гормонам, значительная часть его эффектов связана с контролем репродукции у самок [50, 79, 193, 194]. В наибольшей степени изучено влияние ПРЛ на активность желтого тела, лактацию и материнское поведение, тогда как его роль в регуляции фолликулогенеза продолжает оставаться неясной. Ранее полагали, что эта роль скорее негативна, основываясь на феномене лактационного анэструса, который наблюдается у некоторых видов [340]. Однако впоследствии было установлено, что данный феномен обусловлен главным образом сосательными стимулами и отрицательным энергетическим балансом в период лактации [341, 519]. Наиболее убедительные доказательства важности гонадотропной функции ПРЛ получены при исследовании мышей с нокаутом генов, кодирующих сам гормон или его рецептор [58, 79]. Гомозиготные самки таких мышей полностью стерильны, причем наряду с лютеальной дисфункцией у них наблюдаются определенные аномалии в развитии фолликулов. Следовательно, блокирование действия ПРЛ в организме мышей приводит к нарушению нормального процесса фолликулогенеза.
В имеющейся литературе практически нет информации, касающейся ро-