Строение активного центра, физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы у представителей различных экологических групп бактерий

• Автор: Парфенова, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 139 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика фототрофных бактерий
1.1.1. Типы метаболизма пурпурных бактерий
1.1.2. Морфофизиологические особенности фототрофных пурпурных бактерий
1.1.2.1. Морфологические характеристики
1.1.2.2. Экофизиология фототрофных пурпурных бактерий
1.1.3. Систематическое положение и морфофизиологические особенности бактерий Rhodovulum steppense
1.1.4. Распространение и структура алкалофильного и галоалкалофильного микробных сообществ
1.2. Характеристика бактерий рода Sphaerotilus
1.2.1. Морфологические особенности
1.2.2. Характеристика Sphaerotilus natans
1.3. Общая характеристика малатдегидрогеназы
1.3.1. Способы получения высокоочищенных препаратов МДГ
1.3.2. Общая характеристика каталитического действия
1.3.3. Молекулярная масса малатдегидрогеназы
1.3.4. Влияние концентрации ионов водорода на активность МДГ
1.3.5. Влияние интермедиатов и ионов
1.3.6. Влияние температуры на активность МДГ
1.3.6.1. Термостабильность
1.3.6.2. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
1.4. Структура малатдегидрогеназы
1.4.1. Уровни организации молекулы МДГ
1.4.2. Структура и функции активного центра МДГ
1.4.3. Основные методы изучения структуры и аминокислотного состава активных центров

1.5. Особенности малатдегидрогеназы, выделенной из организмов,
живущих в экстремальных условиях
1.5.1. Характеристика малатдегидрогеназы из галофильных бактерий
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Цель и задачи исследования
2.2. Объекты и методы исследования
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1.Состав питательных сред для культивирования
микроорганизмов
2.2.2.2. Определение активности ферментов
2.2.2.3. Определение количества белка
2.2.2.4. Выделение и очистка малатдегидрогеназы
2.2.2.5. Электрофоретические исследования
2.2.2.5.1. Аналитический электрофорез
2.2.2.5.2.Определение гомогенности ферментных препаратов
2.2.2.5.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы
2.2.2.5.4. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ
2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента
2.2.2.7. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов
2.2.2.8. Идентификация аминокислотных остатков
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных
2.3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.3.1. Получение гомогенных препаратов МДГ из бактерий Rhodovulum
steppense A-20s, Sphaerotilus natans Д
2.3.1.1 .Очистка малатдегидрогеназы
2.3.1.2.Определение гомогенности ферментных препаратов
2.3.1.3.Определение молекулярной массы и субъединичного строения малатдегидрогеназы

2.3.2. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ
2.3.2.1. Влияние концентрации ионов водорода
2.3.2.2. Определение константы Михаэлиса
2.3.2.3. Определение константы субстратного ингибирования
2.3.2.4. Влияние ионов двухвалентных металлов и интермедиатов на активность МДГ
2.3.2.5. Влияние температуры
2.3.2.5.1. Температурный оптимум
2.3.2.5.2. Термостабильность МДГ
2.3.3. Идентификация аминокислотных остатков активного центра
малатдегидрогеназы
2.3.3.1. Модификация МДГ диэтилпирокарбонатом
2.3.3.1.1. Защитное действие оксалоацетата
2.3.3.1.2 Расчет количества аминокислотных остатков гистидина в
активном центре МДГ
2.3.3.2. Модификация МДГ н-хлормеркурибензоатом
2.3.3.2.1. Защитное действие оксалоацетата
2.3.3.2.2. Расчет количества аминокислотных остатков цистеина в активном центре МДГ
2.3.3.3. Модификация МДГ 2,3-бутандионом
2.3.3.3.1. Защитное действие оксалоацетата
2.3.3.3.2. Расчет количества аминокислотных остатков аргинина в активном центре МДГ
2.3.3.4. Модификация МДГ пиридоксаль-5-фосфатом
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

определенных пределов концентраций ионов водорода в растворе. Изоферменты МДГ из разных источников различаются между собой по зависимости их каталитической активности от pH. Оптимальные значения pH для каталитического действия ферментов обычно соответствуют концентрации ионов водорода внутри клеточных структур. Изменение pH даже в узком диапазоне может приводить к существенному изменению параметров, характеризующих состояние белка (Коэн, 1986).
Установлено, что оптимумы pH для прямой и обратной реакций не совпадают. Это объясняется тем, что МДГ катализирует окисление и восстановление субстратов в двух различающихся по своим параметрам конформационных состояниях (Блюменфельд, Плешанов, 1986).
Ряд факторов, таких как макроокружение и специфичные взаимодействия между макромолекулами и клеточными структурами, способны влиять на функциональное состояние малатдегидрогеназы и регулировать зависимость ее активности от концентрации ионов водорода (Chen, Smith, 2001; Bjork et al., 2003).
1.3.5. Влияние интермедиатов и ионов
Активность малатдегидрогеназы in vivo регулируется с помощью множественных низкомолекулярных соединений, большинство из которых представляет собой вторичные продукты метаболизма (Sheikh, Katiyar, 1992). Так, например, активность фермента может регулироваться с помощью некоторых соединений, являющихся субстратами-аналогами этого белка (малонат, фумарат, цитрат, цис-аконитат). Однако, было установлено, что цитрат активирует митохондрильную МДГ из печени цыплят (Dordal et al., 1990), при этом не влияя на тетрамерный фермент из Bacillus sp. (Wynne et al.,1996).
Взаимодействие МДГ с липидным слоем внутриклеточных мембран, а также с у-аминомасляной кислотой повышает стабильность молекулярной