Регуляция активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени крыс при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов

• Автор: Цветикова, Любовь Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 227 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Свойства, биологическое значение и роль в развитии апоптоза фактора некроза опухоли-а

1.1.1. Общая характеристика фактора некроза опухоли-а и его участие

в апоптотических процессах

1.1.2. Механизм развития ФНО-а-индуцированного апоптоза

1.1.3. Роль апоптоза в развитии различных заболеваний

1.1.3.1. Развитие оксидативного стресса при апоптозе

1.2. Биохимические изменения в печени при токсическом воздействии
1.3. Гепатопротекторы
1.3.1. Тиоктовая кислота: биологические и антиоксидантные свойства
1.3.2. Мелатонин: характеристика и антиоксидантные свойства
1.4. Изоцитратдегидрогеназы
1.4.1. Катализируемая реакция. Участие в физиолого-биохимических процессах
1.4.2. Характеристика НАД- зависимой изоцитратдегидрогеназы
1.4.2.1. Очистка, структура и молекулярная масса НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы
1.4.2.2. Кинетические свойства и регуляция активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы
1.4.2.2.1. Зависимость активности НАД-изоцитратдегидрогеназы от концентрации субстрата и коферментов
1.4.2.2.2. Активаторы и ингибиторы НАД-изоцитратдегидрогеназы
1.4.2.2.3. Влияние pH и температуры на активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы
1.4.2.2.4. Другие механизмы регуляции НАД-изоцитратдегидрогеназы

1.4.3. Характеристика НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
1.4.3.1. Очистка, структура и молекулярная масса НАДФ- зависимой изоцитратдегидрогеназы
1.4.3.2. Кинетические свойства и регуляция активности НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы
1.4.3.2.1. Зависимость активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы от концентрации субстрата и коферментов
1.4.3.2.2. Активаторы и ингибиторы НАДФ- изоцитратдегидрогеназы
1.4.3.2.3. Влияние pH и температуры на активность НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы
1.4.3.2.4. Другие механизмы регуляции НАДФ-
изоцитратдегидрогеназы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект.исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Создание модели индукции апоптоза
2.2.2. Введение гепатопротекторов на фоне развития апоптоза
2.2.3. Определение активности ферментов
2.2.3.1. Определение активности оксидоредуктаз
2.2.3.2. Определение активности аминотрансфераз
2.2.4. Определение содержания белка
2.2.5. Оценка антиоксидантного статуса в крови и печени крыс
2.2.5.1. Оценка интенсивности свободнорадикальных процессов методом хемилюминесценции
2.2.5.2. Определение содержания диеновых конъюгатов
2.2.5.3. Определение содержания восстановленного глутатиона
2.2.6. Определение степени фрагментации ДНК
2.2.7. Выделение и очистка НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ
2.2.7.1. Получение субклеточных фракций гепатоцитов и выделение

НАД-и митохондриальной НАДФ-изоцитратдегидрогеназ
2.2.7.2. Экстракция цитоплазматической НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы
2.2.7.3. Фракционирование белков сульфатом аммония
2.2.7.4. Гель-фильтрация на колонке с сефадексом
2.2.7.5. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе
2.2.7.6. Г ель-хроматография на Тоуорегі Н¥
2.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов
2.2.9. Аналитический электрофорез
2.2.10. Определение молекулярной массы ферментов
2.2.11. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА В КРОВИ И ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ, ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ
3.1. Сравнительная характеристика активности аминотрансфераз в сыворотке крови крыс
3.2. Содержание диеновых коньюгатов и параметры
хемилюминесценции в печени и сыворотке крови крыс
3.4. Исследование степени фрагментации ДНК в геиатоцитах крыс
3.4. Активность глутатионовой антиоксидантной системы, НАД
НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени и сыворотке крови крыс
ГЛАВА 4. СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ, ОЧИСТКА И МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА НАД- И НАДФ-ЗАВИСИМЫХ
ИЗОЦИТР АТДЕГИДРОГЕНАЗ
4.1. Компартментализация и активность НАД- И НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в субклеточных фракциях гепатоцитов крыс
4.2. Очистка НАД- и НАДФ- изоцитратдегидрогеназ из печени крыс
4.3. Молекулярная масса НАД- и НАДФ- изоцитратдегидрогеназ
ГЛАВА 5. КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА НАД-

Предполагают, что катаболизм глюкозы, глутамина, лейцина и валина лимитирован функционированием ЦТК [204].
Таким образом, можно заключить, что на уровне 2-ОГ происходит пересечение основных путей углеродного и азотного обмена.
Следует отметить, что в ходе ИДГ- реакции происходит образование таких восстановительных эквивалентов, как НАДН и НАДФН [93, 298], необходимых для функционирования НАД(Ф)Н-зависимых ферментов [5, 314].
Известно, что клетки млекопитающих и дрожжей содержат три класса изоферментов ИДГ: митохондриальные НАД- и НАДФ-зависимые ИДГ (мНАДФ-ИДГ) и цитоплазматическую НАДФ-зависимую ИДГ (цНАДФ-ИДГ) [201, 68]. Кроме того, известен четвертый класс - пероксисомальная НАДФ' зависимая ИДГ, обнаруженная в дрожжах [221].
Полагают, что ИДГ играет немаловажную роль в функционировании АОС организма [165, 250, 352, 367]. Так, рядом авторов было отмечено, что мНАДФ-ИДГ играет значительную роль в образовании восстановительных эквивалентов для ГП/ГР -системы митохондрий, что имеет большое значение для работы АОС [153, 240, 249, 342, 295, 360].
Реакция, катализируемая цНАДФ-ИДГ также связана с ферментативными превращениями окисленного и восстановленного глутатиона в условиях развития ЭТГ крыс [5].
В целом, функцией НАДФ-ИДГ является преимущественно участие в биосинтетических процессах клетки [66 ,144, 210]. Было показано, что НАДФ-ИДГ принимает участие также в регуляции апоптоза [295, 343]. Уменьшение активности НАДФ-ИДГ [361, 362] приводит к увеличению чувствительности клеток к факторам, индуцирующих апоптоз.