Участие генов, индуцируемых метанолом, в росте и устойчиовсти растений к стрессу

• Автор: Поздышев, Денис Валерьевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Пектин и пектинметилэстераза: общие сведения
Рост листа: sink и source зоны листа
Модификация пектина в росте и развитии растения
Реакция гена ПМЭ на стрессовое воздействие на растение
Метанол растительной клетки: происхождение и метаболизм
Эмиссия метанола растением
Эмиссия метанола в условиях стресса
Летучие органические соединения растений с сигнальной функцией
Летучие органические соединения и вирусная инфекция
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Используемые растения
Нозерн-блот анализ
Измерение метанола в среде
Измерение метанола в соке растений
Газовая хроматография
Подавляющая вычитающая гибридизация
Методы биоинформатики и статистического анализа
qRT-PCR (количественная ПЦР в реальном времени с предварительным
получением кДНК)
Плазмиды
Обратная транскрипция
Определение ферментативной активности ПМЭ
Измерение ферментативной активности GUS
Детекция флуоресценции GFP
Агроинфильтрация растений
Тест на связывание белков на мембране в ренатурирующих условиях (overlay assay)
Подготовка проб из зон агроинъекции для разделения электрофорезом
в ПААГ (полиакриламидном геле)
Измерение апертуры устьиц
Инокуляция ВТМ
Иммунизация мышей

Вестерн-блот анализ
Выделение тотальной фракции РНК из растений с помощью TRI Reagent
Фракционирование листового материала
5’-RACE (rapid fmplification of cDNA ends) метод
«Прогулка по хромосоме» для изоляции npNCAPP и прПМЭ
Получение трансгенных растений npNCAPP-GUS
Обработка растений метанолом
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА I. Гены, индуцируемые метанолом (ГИМ), в ответе растений на стресс
1.1. Синтез метанола при механической травме растения
1.2. ГИМ: реакция на механическую травму
1.3. ГИМ активируют межклеточный транспорт
1.4. Участие ГИМ в вирусной инфекции
ГЛАВА И. ГИМ: участие в процессе роста и развития листьев табака
И. 1. Влияние метаболического метанола на регуляцию ГИМ
11.2. Новые ГИМ с дифференциальной экспрессией в sink и source зонах листа
ГЛАВА III. Механизм обратной связи в цикле «м етан ол-NCA РР-ПМЭ-Mcrai i о л ».
III. 1. Промотор rcuaNCAPP чувствителен к метанолу
111.2. Экспрессия гена ПМЭ зависит от экспрессии гена NCAPP
111.3. Уровень транскрипции гена ПМЭ влияет на уровень эмиссии метанола
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования. Растения, не имея возможности избежать стрессовых воздействий среды, выработали способность эффективно на них отвечать (Kissoudis et al., 2014). Болес того, растения способны синтезировать летучие органические соединения (JIOC), которые играют роль химических сигналов, передающих информацию о стрессе на значительные расстояния. Такие сигналы могут быть приняты другими растительными организмами, повышая их шансы на эффективный ответ (Holopainen and Blande, 2012). В качестве примеров соединений с подобной функцией можно назвать JIOC зеленых листьев, терпены, фитогормоны, такие как этилен и метилированные производные жасмоновой и салициловой кислот (Dorokhov et al., 2014).
Метанол, или древесный спирт, является ЛОС растений, функция которого неизвестна. До недавнего времени метанол рассматривался как побочный продукт роста клетки (von Dahl et al., 2006). Источник метанола в растении — реакция деметилирования пектина с участием фермента пектинметилэстсразы (ПМЭ) в процессе модификации и повреждения клеточной стенки (Pelloux et al., 2007). ПМЭ отщепляет метальные группы от сложных эфиров галактуроновых кислот пектина с образованием метанола. Известно, что ПМЭ повышает устойчивость растений ко многим биотическим стрессам, а атака фитофага и механическое повреждение листа сопровождается резким выбросом в атмосферу газообразного метанола. Для исследования влияния метанола на растение группа исследователей наносила метанол на листья Arabidopsis thaliana и анализировала изменение экспрессии генов в листьях с помощью микрочипов (Downie et al., 2004). Среди генов, транскрипция которых изменялась в ответ на обработку метанолом, были гены, кодирующие белки, вовлеченные в детоксикацию, в том числе цитохром Р450, глюкозилтрансфераза и члены семейства транспортеров ЛВС (АТР binding cassette). Авторы пришли к выводу, что опрыскивание метанолом активирует детоксикацию и сигнальные системы. Однако в упомянутой работе был использовал 10% раствор метанола, что в десятки тысяч раз превышает физиологический уровень метанола (von Dahl et al., 2006).
Стоит отметить, что метанол не является ядом для растений. Обработка растений растворами с высокими концентрациями метанола (10-50%) приводит к ускорению роста и развития культурных СЗ растений в засушливых условиях (Nonomura and Benson, 1992).
В нашей лаборатории была выдвинута гипотеза о метаноле как регуляторе иммунного ответа растительной клетки.
Степень разработанности темы. Данная работа посвящена экспериментальному подтверждению гипотезы о физиологической и эпигенетической функции метанола. Был

200М с использованием следующих фильтров: ВР470/40 (возбуждение) и ВР525/50 (испускание) («Zciss», Германия).
Лгроинфнльтрацня растений
Agrobacterium tumefaciens штамм GV3101 трансформировали соответствующим бинарным вектором. Ночную культуру выращивали в LB среде с антибиотиками рифампицином (50 мг/л), гентамицином (25 мг/л), канамнцииом (50 мг/л) при 28°С. Полученную культуру бактерий разводили буфером, содержащим 10 мМ MES (pH 5,5) и 10 мМ MgCb, до плотности, соответствующей OD6oo 0,001-0,1 в зависимости от эксперимента, и вводили в лист с помощью шприца без иглы.
При совместной инфильтрации агробактернями, несущими разные генетические конструкции, использовали разведение, соответствующее OD^oo 0,1 для каждой из них в смеси, кроме экспериментов с участием 2xGFP.
В экспериментах по анализу межклеточного транспорта для получения отдельных светящихся 2xGFP клеток использовали разведение бактериальной суспензии, ■ соответствующее OD6oo~0,01. Растения инкубировали в атмосфере с повышенной ' концешрацней метанола, агроинфильтрировали, а затем через 30 часов подсчитывали кластеры светящихся клеток с помощью флуоресцентного светового микроскопа. В экспериментах по • оценке межклеточного транспорта вирусного вектора KpBTM:GFP размер фокусов определяли через 3 суток после обработки растения метанолом.
Тест на связывание белков на мембране в рснатурнрующнх условиях (overlay
assay)
Схема эксперимента базируется на протоколе (Ucki et al., 2011). Иммобилизация исследуемых белков на мембране проходит по стандартной методике (см. вестерн-блот анализ). После этого происходит отмывка 15 минут в буфере В (30 мМ Tris-HCl pH 7,4, 0.05% Twcen-20) при покачивании. Затем инкубация 2 часа в денатурирующем буфере при комнатной температуре (7 М гуанидин гидрохлорид, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ ДТТ, 50 мМ Tris-HCl pH 8,0). После этого промывка 5 минут в буфере TBS-T (140 мМ NaCl, 30 мМ Tris-HCl pH 7,4, 0,1% Tween-20) и стадия ренатурации и блокировки мембраны на ночь при +4°С в буфере для ренатурации (140 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl pH 7,4, 2 мМ ЭДТА, 1% БСА, 0,1% Tween-20, 2 мМ ДТТ). Затем стадия связывания белков из среды в буфере для ренатурации 90 минут с тестовым белком (в данной работе это NCAPP или ТБ ВТМ). После этого промывка в TBS-T и инкубация с антителами. Далее системой детекции метод повторяет вестери-блот анализ.