Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 и создание штаммов-суперпродуцентов

• Автор: Машков, Олег Игоревич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 105 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Строение четырёх-нитевого перекреста (структуры Холлидея)
1.1.1. Особенности строения структуры Холлидея
1.2. Молекулярные основы генетической рекомбинации
1.3. Обзор структуры ферментов, ответственных за разрешение
структуры Холлидея
1.3.1. Глобальная молекулярная структура резолваз
1.3.2. Молекулярная организация активного центра резолваз
1.3.3. Молекулярная структура комплекса ДНК-перекрест-резолваза
1.3.3.1. Кинетика ассоциации Т4 эндонуклеазы VII со структурой Холлидея
1.3.3.2. Кинетика ассоциации Т7 эндонуклеазы I со структурой Холлидея
1.4. Характеристика эндонуклеазы I бактериофага Т7
1.4.1. Молекулярная структура эндонуклеазы I бактериофага Т7
1.4.2. Связывание Т7Е1 со специфическим субстатом
1.4.3. Активный центр Т7 эндонуклеазы
1.5. Гетерологичные системы экспрессии в бактерии E.coli
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объекты исследований
2.2. Выделение и очистка ДНК бактериофага Т7
2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.4. Выделение и очистка нуклеиновых кислот
2.5. Микровыделение плазмидной ДНК
2.6. Полимеразная цепная реакция

2.7. Электрофоретическое фракционирование ампликонов и
исходных молекул нуклеиновых кислот
2.8. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.9. Создание ДНК-перекреста
2.10. Расщепление ДНК-перекреста эндонуклеазой I бактериофага

2.11. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом
2.12. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.13. Приготовление компетентных клеток E.coli
2.14. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК
2.15. Экспрессия Т7 эндонуклеазы
2.16. Выделение Т7 эндонуклеазы
2.17. Аффинная хроматография белкового экстракта
2.18. Электрофоретическое фракционирование белков в денатурирующих условиях
2.19. Основные реактивы, использованные в работе
2.20. Составы использованных стандартных водных растворов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Амплификация гена эндонуклазы I бактериофага Т7
3.2. Клонирование гена Т7 эндонуклеазы I в плазмидную
векторную конструкцию рККХ
3.3. Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в
экспрессирующую векторную молекулу рЕТ-За
3.4. Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в
экспрессирующие векторные молекулы pQE-ЗО и PinPointXA
3.5. Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в
экспрессирующую векторную молекулу рЕТ
3.6. Экспрессия рекомбинантной векторной молекулы рЕТ-

22ЬТ7(с17)
3.7. Аффинная хроматография клеточного лизата индуцированной
культуры, содержащей рекомбинантную молекулу рЕТ-22ЬТ7(с17)
3.8. Исследование ферментативной активности очищенного
белкового продукта из клеточного лизата рЕТ-22ЬТ7(с17)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Рисунок 10. Схема регуляторной и функциональной области векторной молекулы для гетерологичной экспрессии белков в клетках E.coli Пояснения в тексте.
Ген целевого экспрессируемого белка, который может быть практически любого происхождения, изображен на схеме на рис. 10 в виде прямоугольника “Coding sequence”, его фланкируют стартовый и терминирующий кодоны трансляции. Причем, как видно из рис. 10 для E.coli характерно использование AUG, тогда как стартовый кодон GUG встречается намного реже, а кодон UUG всего лишь в 1% случаев. Что касается терминирующего кодона, то для E.coli как показали результаты секвенирования множества генов кишечной палочки, наиболее эффективен кодон UAA, сопровождаемый еще одним остатком U. Располагающийся далее бокс «ТТ» символизирует последовательность, отвечающую за терминацию транскрипции. Бокс «Р» изображает присутствие промотора, в котором показано наличие регуляторных участков -35 и -10. Под аббревиатурой «RBS» закодирован участок связывания с рибосомой (Ribosome Binding Site), включающий так называемую последовательность SD (Shine-Dalgamo), взаимодействующую с 3’-концом 16S рРНК в рибосоме. Бокс «R» означает репрессор, если таковой присутствует. Бокс “AmpR” показывает наличие гена устойчивости к какому-либо антибиотику (в данном примере к ампициллину), который позволяет как вести селекцию при отборе рекомбинантных конструкций, так и оказывать селективное давление при культивировании. И наконец, бокс “Ori” символизирует ориджин репликации, без которого любая векторная система не будет способна к независимой репликации.