Вариабельные домены антител, направленных к интерлейкину-18, интерферону-γ и фактору некроза опухолей, в норме и при рассеянном склерозе

• Автор: Тюменцева, Марина Алексеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 223 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Формирование многообразия антител

1.1.1. Строение иммуноглобулинов

1.1.2. Образование функционального иммуноглобулинового гена

1.1.3. Аффинное созревание антител

1.2. Аутоантитела в норме и при патологии

1.2.1. Аутоантитела. Общие понятия

1.2.2. Антицитокиновые аутоантитела

1.3. Антитела при рассеянном склерозе

1.3.1. Антитела, специфичные кмиелиновым антигенам
1.3.2. Антитела, специфичные к аксональным и нейрональным антигенам
1.3.3. Антитела, специфичные к антигенам олигодендроцитов
1.3.4. Антитела, специфичные к вирусным антигенам
1.3.5. Антитела, участвующие в процессе ремиелинизации
1.3.6. Антитела, специфичные к цитокшшм
1.4. Фаговый дисплей
2. ПАЦИЕНТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Пациенты и здоровые доноры
2.2. Материалы
2.2.1. Реактивы
2.2.2. Библиотеки, бактерии и бактериофаги
2.2.3. Растворы и буферы
2.2.4. Культуральные среды
2.3. Методы
2.3.1. Измерение концентрации ИЛ-18 и выявление анти-ИЛ-18 аутоАТв
сыворотках крови больных РС и здоровых доноров
2 3.2. Амтификация фаговой библиотеки антител
2.3.3. Аффинная селекция фаговых антител
2.3.4. Отбор фаговых антител
2.3.5. Иммуноферментный анализ фаговых антител
2.3.6. Выделение фагмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.3.7. Амтификация генов, кодирующих 011АТ
2.3.8. Определение и анализ нуклеотидных последовательностей генов оцАТ.
2.3.9. Репертуары последовательностей антител при АИЗ, полученные из базы данных ОепЬапк ИСВ
2.3.10. Статистический анализ данных
2.3.11. Электрофоретический анализ белков
2.3.12. Вестерн-блот анализ
2.3.13. Трансформация клеток Е. соИ фагмидной ДНК
2.3.14. Получение экспрессии оцАТ
2.3.15. Получение отдельных клеточных фракций, содержащих оцАТ
2.3.16. Очистка препаратов оцАТ методом метапл-хелаптой хроматографии с использованием сорбента ЫйКТА
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Уровень анти-ИЛ-18 аутоАТ и концентрация ИЛ-18 в сыворотках крови больных
РС и здоровых доноров

3.2. Разнообразие генных сегментов, кодирующих вариабельные домены фаговых антител из МБ и N комбинаторных библиотек
3.3. Обогащение МБ и N библиотек клонами, продуцирующими фаговые антитела, направленные к ИЛ-18, ИФН-у и ФИО
3.4. Отбор фаговых антител, направленных к ИЛ-18, из МБ и N библиотек
3.5. Разнообразие генных сегментов, кодирующих вариабельные домены анти-ИЛ-18 антител, отобранных из МБ и N библиотек
3.6. Сравнение генных сегментов, кодирующих вариабельные домены анти-ИЛ-18 АТ, отобранных из МБ и N библиотек, с генами зародышевых линий
3.7. Изоэлектрические точки вариабельных доменов анти-ИЛ-18 АТ, отобранных из МБ и N библиотек
3.8. Длина и изоэлектрическая точка СИЯЗн и СЭЛЗь последовательностей, ТйТ и экзонуклеазная активность в щгкДюп-участке анти-ИЛ-18 АТ, отобранных из МБ и N библиотек
3.9. Оценка потенциального селективного давления со стороны антигена на вариабельные домены анти-ИЛ-18 АТ, отобранных из МБ и N библиотек
3.10. Исследование иммунохимических свойств фаговых антител, направленных к ИЛ-
3.11. Отбор фаговых антител, направленных к ИФН-у, из МБ и N библиотек
3.12. Разнообразие генных сегментов, кодирующих вариабельные домены анти-ИФН-у антител, отобранных из МБ и N библиотек
3.13. Сравнение генных сегментов, кодирующих вариабельные домены анти-ИФН-у АТ, отобранных из МБ и N библиотек, с генами зародышевых линий
3.14. Сочетания Ун и Уь доменов в анти-ИФН-у оцАТ, отобранных из МБ и N библиотек
3.15. Изоэлектрические точки вариабельных доменов анти-ИФН-у АТ, отобранных из МБ и N библиотек
3.16. Длина и изоэлектрическая точка СИЛЗн и СОЯЗт последовательностей, ТсГГ и экзонуклеазная активность в ]ипс1юп-участке анти-ИФН-у АТ, отобранных из МБ и N библиотек
3.17. Оценка потенциального селективного давления со стороны антигена на вариабельные домены анти-ИФН-у АТ, отобранных из МБ и наивной библиотек
3.18. Исследование иммунохимических свойств фаговых антител, направленных к ИФН-у
3.19. Отбор фаговых антител, направленных к ФНО, из МБ и N библиотек
3.20. Разнообразие генных сегментов, кодирующих вариабельные домены анти-ФНО антител, отобранных из МБ и N библиотек
3.21. Сравнение генных сегментов, кодирующих вариабельные домены анти-ФНО АТ, отобранных из МБ и N библиотек, с генами зародышевых линий
3.22. Сочетания Ун и Уь доменов в анти-ФНО оцАТ, отобранных из МБ и N библиотек
3.23. Изоэлектрические точки вариабельных доменов анти-ФНО АТ, отобранных из МБ и N библиотек
3.24. Длина и изоэлектрическая точка СБЯЗн и СИ^ последовательностей, ТйТ и экзонуклеазная активность в ЗипсПюп-участке анти-ФНО АТ. отобранных из МБ и N библиотек
3.25. Оценка потенциального селективного давления со стороны антигена на вариабельные домены анти-ФНО АТ, отобранных из МБ и N библиотек
3.26. Исследование иммунохимических свойств фаговых антител, направленных к ФНО
4. ОБСУЖДЕНИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ

2003; Cid C. et al., 2004; Pirko I. et al., 2004; Schwab M.E., 2004; Cid C. et al., 2005; Mi S. et al., 2007].
1.3.6. Антитела, специфичные к цитокинам
Считают, что цитокины и другие регуляторные молекулы могут играть важную роль в патогенезе PC. Известно, что концентрация ИЛ-18 повышена в сыворотке крови больных PC [Losy J., Niezgoda A., 2001; Nicoletti F. et al., 2001; Chen Y.C. et al., 2012]. За регуляцию уровня ИЛ-18 в организме наряду с ИЛ-18СБ отвечают анти-ИЛ-18 аутоантитела, эта регуляция может быть нарушена (может изменяться) при АИЗ [Losy J., Niezgoda А., 2001; Millward J.M. et al., 2010; Novick D. et al., 2010]. Полагают, что при PC повышенная концентрация ИЛ-18, приводящая к индукции индоламин 2,3-диоксигеназы и хинолиновой кислоты, опосредует судорожную активность [Anderson G., Rodriguez М., 2011]. Также, ИЛ-18 стимулирует экспрессию ИФН-у, который в свою очередь стимулирует экпрессию молекул МНС класса II клетками микроглии. Экспрессия молекул МНС класса II приводит к презентации антигенов этих клеток и активации аутореактивных клонов Т-хелперов и Т-киллеров, что может быть причиной развития PC [Kawanokuchi J.et al., 2006]. Помимо повышенной концентрации ИЛ-18, в крови и СМЖ больных PC обнаружен повышенный уровень экспрессии каспазы-1, фермента конвертирующего проИЛ-18 в зрелую форму, причем его уровень коррелирует с активностью течения PC [Furlan R. et al., 1999a; Huang W.X. et al., 2004]. Известно также, что ингибиторы каспазы-1 способны существенно смягчать течение ЕАЕ - животной модели PC [Furlan R. et al., 1999b].
ИФН-у рассматривается в качестве основного провоспалительного цитокина, участвующего в иммуноопосредованной демиелинизации нервных волокон при PC и ЕАЕ [Рорко В. et al., 1997; Sredni-Kenigsbuch, 2002; Lees J.R., Cross A.H., 2007]. Так, ИФН-у стимулирует разрушение миелиновой оболочки и препятствует ремиелинизации [Lin W. et al., 2006], приводя тем самым к значительному ухудшению состояния организма, введение же антител,