Функциональная геномика микоплазм при адаптации к стрессовым условиям внешней среды

• Автор: Фисунов, Глеб Юрьевич
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
1. Введение
1.1 Научная новизна и значимость работы
1.2. Цели и задачи
1.3. Обзор литературы
Молекулярные системы бактерий, участвующие в адаптации к стрессу
Потенциальные регуляторы в геноме Mycoplasma gallisepticum
Механизмы регуляции стрессового ответа у других бактерий
Адаптивные механизмы Mycoplasma gallisepticum
2. Материалы и методы
2.1. Культуральные работы
2.2. Приготовление препаратов ДНК, РНК, белка
2.3. Секвенирование генома Mycoplasma gallisepticum S
2.4. Измерение транскрипционной активности М. gallisepticum (транскриптомика)
2.5. Протеомный анализ М. gallisepticum (протеомика)
2.6. Биохимические исследования
3. Результаты
3.1. Определение полной нуклеотидной последовательности генома М. gallisepticum S6
3.2. Транскрипционный анализ М. gallisepticum
Отработка биологических моделей стрессовых воздействий
Отработка технологии фрагментации РНК
Отработка технологии нормализации траискриптомных библиотек
Воспроизводимость количественных данных по представленности транскриптов
Полногеномное картирование сайтов инициации транскрипции и структура промоторов
М. gallisepticum
Организация транскрипционных единиц в геноме М. gallisepticum
Некодирующие РНК в геноме М. gallisepticum
Транскрипционный ответ М. gallisepticum на стрессовые воздействия
Ингибиторный анализ транскрипционного ответа М. gallisepticum
3.3. Протеомный анализ М. gallisepticum
Анализ функционального протеомного ядра молликут в стрессовых воздействиях
Белковый ответ М. gallisepticum на стрессовые воздействия
3.4. Модель стрессовой адаптации М. gallisepticum
4. Заключение
5. Выводы
6. Список литературы
7. Список иллюстраций
8. Приложение
8.1. Транскрипционное профилирование генов М. gallisepticum методом
высокопроизводительного секвенирования
8.2. Транскрипционное профилирование генов М. gallisepticum методом ОТ-ПЦР в реальном
времени
8.3. Измерение представленности белков М. gallisepticum
1. Введение
1.1 Научная новизна и значимость работы
Микоплазмы - представители класса Молликут (Mollicutes). Термины микоплазмы и молликуты в настоящее время стали, в значительной степени, синонимами, хотя традиционная классификация выделяет в классе молликут род Mycoplasma. В настоящей работе эти термины будут употребляться как эквивалентные. Молликуты - специализированная ветвь микроорганизмов, родственная грамм-положительиым бактериям и, в частности, Lactobacillus [I]. Микоплазмы являются, как правило, облигатными паразитами, но среди них встречаются комменсалы, а также свободноживущие виды, которые могут быть факультативными паразитами [2]. Среди облигатных паразитов также встречаются внутриклеточные, такие как Mycoplasma penetrans. Впервые представитель микоплазм был выделен в 1898 году Нокардом и Ру [3]. Это был возбудитель бычьей плевропневмонии, впоследствии получивший название Mycoplasma mycoides. Таким образом, история изучения микоплазм насчитывает более ста лет. Таксономическая принадлежность микоплазм долгое время оставалась неясной, вследствие ряда особенностей, нехарактерных для большинства бактерий. Это является, в свою очередь, следствием высокой специализации микоплазм к паразитическому образу жизни. Одним из главных отличий молликут от большинства бактерий является полное отсутствие клеточной стенки. В связи с этим, в прошлом молликут часто отождествляли с L-формами бактерий [4]. Микоплазмы также отличаются меньшим, по сравнению с большинством бактерий, размером. Средний размер микоплазм составляет 500-600 нм вдоль длинной оси клетки [5]. Клетки микоплазм, ввиду отсутствия клеточной стенки, имеют неправильную форму, близкую к грушевидной. При
этом клетки молликут является чрезвычайно пластичными, что вкупе с небольшим размером позволяет микоплазмам проходить через большинство фильтров, задерживающих обычных бактерий [6].
Другой важной особенностью микоплазм является редукция генома и связанная с ней общая редукция молекулярных систем клетки, что, по-видимому, обусловлено паразитическим образом жизни [7]. Размеры бактериальных геномов могут варьировать от 180 тысяч пар оснований (п.о.) у облигатного внутриклеточного симбионта Carsonella rudii до 13 миллионов и.о. у почвенного микроорганизма Sorangium cellulosiim. Распределение длин известных бактериальных геномов имеет бимодальную структуру с двумя пиками в области 2 и 5 миллионов и.о. Это обстоятельство позволяет разделить бактерий на две категории - с «большими» и «маленькими» геномами [8]. Молликуты относятся ко второй категории и их геномы насчитывают порядка миллиона п.о. Mycoplasma genitalium с геномом в 580 тысяч п.о. является бактерией с наименьшим геномом, способной расти на искусственной питательной среде. Определение полной нуклеотидной последовательности генома Mycoplasma genitalium послужило поводом для дискуссии о «минимальной клетке» и «минимальном геноме» [9]. Проблема минимальной клетки была сформулирована вскоре после опубликования первых последовательностей полных геномов. Задача о минимальной клетке ставит вопрос, сколько белков (и соответствующих генов) необходимо и достаточно для того, чтобы клетка могла делиться на искуственной питательной среде. Сравнительная геномика, в зависимости от количества рассматриваемых видов, в разное время давала результат от 250 [10] до 50 [11] генов. Инактивация генов М. genitalium с помощью транспозонов в двух разных экспериментах позволила определить, что 265 и 350 из 517 генов являются необходимыми [12]. Сравнительный протеомный подход для трёх видов микоплазм позволяет определить 212 минимально необходимых белков (Рисунок

соответствующих мРНК. ROSE-элементы (Repression Of Heat Shock Gene Expression) были обнаружены в бактериях родов Bradirhizobium, Rhizobium and Mesorhizobium [72]. Они управляют экспрессией альтернативного сигма-фактора и ряда белков теплового шока. ROSE-элементы представляют собой шпильку с двуцепочечной областью длиной порядка 17 п.о. с небольшим неспаренным участком в центре и выпетливанием G в области последовательности Шайна-Дальгарно. Неспаренные области снижают стабильность шпильки таким образом, чтобы её плавление происходило в диапазоне температур, физиологичном для данного организма. Последовательность Шайна-Дальгарно и старт-кодон входят в состав шпильки и недоступны для рибосомы. При повышении температуры шпилька плавится, открывая доступ для рибосомы. FourU-элемент был обнаружен у сальмонелл, и принцип его работы аналогичен таковому у ROSE-элемента [73]. В отличие от ROSE-элемента, дестабилизация FourU-элемента обеспечивается трактом из 4 U оснований в середине шпильки.
Механизмы регуляции стрессового ответа у других бактерий
Гены регуляторов далеко не всех типов найдены в геноме М. gallisepticum. Так полностью отсутствуют регуляторы ответа на окислительный стресс и на повреждение ДНК (SOS-ответ), несмотря на их широкое распространение среди других бактерий. При этом далеко не все белки М. gallisepticum имеют известную функцию, а из 9 кандидатных ТФ только 2 имеют известную функцию - НгсА и Fur. Поэтому, возможно, соответствующие регуляторы находятся среди тех, функция которых пока не определена. Далее рассмотрены механизмы работы наиболее распространённых семейств ТФ, управляющих ответом на тепловой и окислительный стрессы.
Регуляторы и сенсоры теплового стресса