Структурно-функциональный анализ гена speA, супрессирующего патогенность бактерий рода Erwinia

• Автор: Чернышов, Сергей Вячеславович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 166 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика взаимодействий микроорганизмов с
другими организмами в природе
1.2. Фитопатогенные микроорганизмы
1.2.1. Общие сведения о фитопатогенах и симптоматике вызываемых
ими заболеваний
1.2.2. Классификация фитопатогенных микроорганизмов
1.2.3. Динамика патогенеза, обусловленного эрвиниями, вызывающими мягкие гнили
1.3. Факторы вирулентности фитопатогенных бактерий
1.3.1. Экстраклеточные полисахариды эрвиний
1.3.2. Экстраклеточные ферменты эрвиний, участвующие в деградации клеточной стенки растений
1.3.2.1. Эндопектатлиаза Ре
1.3.2.2. Экзо-полигалактуронатлиаза Ре1Х
1.3.2.3. Экзо-полигалактуронатлиаза Ре1¥
1.3.2.4. Олигогалактуронатлиаза 0§
1.3.2.5. Эндо-пектатлиаза Ре
1.3.2.6. Зависимость энзиматической активности пектиназ от двухвалентных катионов
1.3.3. Харпины как факторы вирулентности бактерий
1.3.4. Структурная организация и регуляция экспрессии генов деполимеризующих ферментов
1.3.4.1. Репрессор
1.3.4. 2. Репрессор РесБ
1.3.4. 3. Репрессор РесТ
1.3.4. 4. Белок-активатор Н-ЫБ
1.3.5. Секреция экстраклеточных факторов вирулентности

фитопатогенами, вызывающими мягкие гнили
1.3.5.1. Система секреции I типа
1.3.5.2. Система секреции II типа
1.3.5.3. Система секреции III типа
1.4. Методы защиты растений от патогенов и вредителей
1.4.1. Химические методы защиты
1.4.2. Биологические методы защиты
1.4.2.1. Создание трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам
1.4.2.2. Колонизация растений ассоциативной микрофлорой
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Оборудование
2.1.2. Реактивы и ферменты
2.1.3. Бактериальные штаммы плазмиды и праймеры
2.1.4. Среды и основные буферы
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Быстрое выделение небольших количеств плазмидной ДНК
методом щелочного лизиса
2.2.2. Модифицированный метод выделения плазмидной ДНК по Бирнбойму и Доли
2.2.3. Модифицированный метод скрининга плазмид в геле
2.2.4. Выделение геномной ДНК из бактериальных клеток
2.2.5. Приготовление электрокомпетентных клеток E. coli и
E. carotovora и процедура трансформации методом электропорации
2.2.6. Проведение реакций модификации ДНК
2.2.7. Получение делеционных производных плазмид
2.2.8. Определение и анализ первичной последовательности ДНК
2.2.9. Приготовление ДНК-зондов и блот-гибридизация по Саузерну
2.2.10. Определение патогенности эрвиний
2.2.11. Определение фенилаланиндезаминазной активности
2.2.12. Получение клеточных лизатов эрвиний
2.2.13. Тестирование мацерирующей активности клеточных лизатов
эрвиний
2.2.14.Разделение тотальных клеточных белков путем электрофореза в SDS-денатурирующем полиакриламидном геле
2.2.15. Проведение иммуноблотинга
2.2.16. Тестирование транскрипционной активности in vitro
2.2.17. Выделение тотальной РНК из клеток бактерий
2.2.18. Культивация растений табака и картофеля in vitro
2.2.19. Определение титра бактериальных клеток в суспензии
2.2.20. Биотестирование цитокининов
2.2.21. Экстракция цитокининов
2.2.22. Идентификация цитокининов
2.2.23. ПЦР-амплификация и секвенирование гена 16S рРНК
2.2.24. Филогенетический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование и свойства плазмиды рАМ
3.1.1. Получение и фенотипический анализ первичных трансформантов эрвиний
3.1.2. Конструирование и рестрикционное картирование плазмиды

3.1.3. Гибридизационный и ПЦР-анализы рАМ
3.1.4. Клонирование рАМ28 и ее фрагментов в клетках E. coli
3.1.5. Испытание различных штаммов эрвиний и трансформантов на устойчивость к антибиотикам
3.1.6. Исследование свойств клеточных лизатов
3.2. Свойства штамма S
3.2.1. Влияние бактерий E.carotovora S14-13 на изолированные листья
табака и картофеля
3.2.2. Колонизация бактериями E. carotovora S14-13 целых растений
3.2.3. Проявление защитного эффекта на растениях табака и картофеля, колонизированных E.carotovora S
3.2.4. Изменение физиолого-морфологических характеристик колонизированных растений в период их вегетации
3.3. Структурно-функциональный анализ плазмиды рАМ

контролем регуляторного белка РесТ (Pissavin et al., 1996). Этот регулятор влияет и на синтез полицистронной мРНК, поскольку ген ре/С также подвержен регуляции РесТ. Интересно, что степень воздействия этого регулятора на операторные участки обоих генов, pelZ и pelC, сопоставима, чего нельзя сказать о влиянии другого регуляторного белка, PecS. Экспрессия гена pelZ в отличие от генов pel А. -В, -С, -D, -Е, и -L совершенно не зависит от этого репрессора (Pissavin et al., 1996).
1.3.2.6. Зависимость энзиматической активности пектиназ от двухвалентных
катионов
Внеклеточные эндо-пектатлиазы Е. chiysanthemi характеризуются абсолютной зависимостью ферментативной активности от ионов Са2+ (Lojkowska et al., 1995; Pissavin et al., 1998; Shevchik et al., 1997; Tardy et al., 1997). Эти ферменты не активируются и не ингибируются другими двухвалентными катионами за исключением пектатлиазы PelZ, которая использует Мп2+ в качестве кофактора с гораздо большей эффективностью, чем ионы Са2+ (Pissavin et а!., 1998; Tardy et al., 1997). Периплазматической экзо-полигалактуронатлиазе PelX для проявления активности также требуется присутствие катионов, и она слабо активируется ионами Са2+, Mn2+, Со2+, Ni2+ и Cu2+ (Shevchik et al., 1999а). Активность двух цитоплазматических пектиназ PelW и Ogl зависит от присутствия двухвалентных ионов, однако ионы Са2+ не способны к ее восстанавлению, хотя некоторые другие катионы металлов с близкими радиусами, такие как Со2+, Мп2+ и Ni2+, могут активировать с различной эффективностью как PelW так и Ogl (Shevchik et al., 1999b). На примере PelW было показано, что катионы непосредственно связываются с белком, в результате чего происходит стабилизация структуры белковой молекулы. Характерно, что обе цитоплазматические пектиназы активируются сходным набором катионов, в то время как набор катионов, требующихся для проявления энзиматической активности экстраклеточных пектатлиаз, существенно отличается.
1.3.3. Харпины как факторы вирулентности бактерий
Харпины можно отнести к дополнительным факторам вирулентности фитопатогенных бактерий, поскольку была получена информация, что hrp-локус требуется для обеспечения патогенности Envinia (Alfano and Collmer, 1997). Био-