Анализ энхансерных РНК, инсуляторных белков и модификаций хроматина в генетических конструкциях, трансфецированных в клетки дрозофилы

• Автор: Федосеева, Дарья Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность проблемы

1.2 Цели и задачи исследования

1.3 Научная новизна результатов исследования

1.4 Научно-практическая ценность

1.5 Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение
2.1 Механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов. Модификации хроматина
2.2 Энхансеры- ДНК элементы, вовлеченные в эпигенетическую регуляцию экспрессии генов
2.2.1 Свойства энхансеров. Модели действия энхансеров
2.2.2 Белки, связанные с работой энхансеров
2.2.3 Свойства энхансера copia Drosophilla melanogaster
2.3 Инсуляторы и их роль в регуляции экспрессии генов
2.3.1 Свойства инсуляторов. Модели действия инсуляторов
2.3.2 Типы инсуляторов Drosophilla melanogaster
2.3.3 Регуляция активности инсуляторов
2.4 Некодирующие РНК и их роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов
2.4.1 Классификация некодирующих РНК. Энхаисериые РНК
2.4.2 Некодирующие РНК как регуляторы транскрипции. Длинные нскодирующие РНК
2.4.3 Механизмы активации транскрипции генов длинными некодирующими РНК. Энхансерные РНК
2.5 Ламина и ее роль в регуляции экспрессии генов
2.5.1 Структурная организация ламины. Ламина у Drosophilla melanogaster
2.5.2 Типы ядерных ламинов Drosophilla melanogaster
2.5.3 Ламина и хроматин. Ламина как регулятор экспрессии генов
Заключение
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Культура клеток Drosophila melanogaster

3.2 Штаммы E.coli и векторы
3.3 Используемые праймеры
3.4 Генетические конструкции, использованные в работе
3.5 Антитела, использованные в работе
3.6 Стандартные молекулярно-биологические методы
3.7 Трансфекция ДНК-конструкций в культуру клеток Schneider 2 дрозофилы
3.8 5’RACE (5’-Rapid Amplification of Complementary Ends)
3.9. Primer-extcntion
3.10 Выделение тотальной РНК из культуральных клеток Schneider 2 Drosophila melanogaster
3.11 Нозсрп-блот анализ
3.12 Иммунопреципитация хроматина
3.13 Полуколичественная PCR
3.14 Подготовка проб для мультиплексного однонаправленного глубокого ссквснирования на платформе
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Анализ распределения TSS в конструкции e-h с помощью 5’ RACE (Rapid Amplification of 5’ Complementary DNA Ends)
4.2 Анализ распределения TSS в конструкции e-h с помощью primer extension
4.2 Размеры энхансерных РНК варьируют от 300 до 1050 п.н
4.3 Анализ распределения модификаций хроматина в генетических конструкциях e-h, e-g-h и g/g
4.4 Анализ связывания инсуляторных белков Su(Hw), [mod(mdg4)]2.2 и dCTCF с различными районами конструкций e-h, e-g-h и g/g
4.4.1 Инсуляторные белки связываются с энхансером copia
4.4.2 С инсулятором gypsy в генетических конструкциях связывается не только Su(Hw), но и dCTCF
4.4.3 Mod2.2 связывается с промотором в конструкции e-h
4.4.4 Инсуляторные белки связываются преимущественно с 5’ областью инсулятора G1 и с З’областью инсулятора G2 в конструкциях e-g-h и g/g
4.5 Анализ взаимодействия геномных копий инсуляторов gypsy, а также инсуляторов комплекса ВХ-С с ламиной
5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Роль энхансеров и инсуляторов в изменении структурно-функционального
состояния хроматина
5.1.1 эРНК и малые петли хроматина

5.1.2 эРНК и модификации хроматина
5.2 Размеры эРНК
5.3 Роль инсуляторных белков в регуляции дистантных взаимодействий
5.4 Участие dCTCF в работе инсулятора gypsy
5.5 Значение ламины в формировании инсуляторных телец и функционировании
инсуляторов
Выводы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

2.4 Некодирующие РНК и их роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов
2.4.1 Классификация иекодирующих РНК. Энхансерные РНК
Роль РНК в передаче генетической информации для дальнейшего биосинтеза белков является центральной догмой биологии. Однако помимо этой важной функции, РНК молекулы выполняют также множество других функций в клетке. Так, недавно была высказана гипотеза, что РНК является своего рода “GPS’’-системой клетки (Kluvve and Ellington., 2010).
В основе многофункциональности РНК лежит способность этой молекулы принимать различные конформации. (Patel and Suri, 2000) В тоже время первичная последовательность РНК способна взаимодействовать с геномной ДНК через спаривание комплиментарных оснований.
Транскрипция у эукариот, как правило, контролируется различными регуляторными белками - коактиваторами и корепрессорами, которые не могут связываться с ДНК, но способны взаимодействовать с активаторами и репрессорами транскрипции соответственно (Thomas and Chiang, 2006). Все эти регуляторные белки, функционирующие на различных стадиях транскрипции, могут быть потенциальной мишенью для некодирующих РНК.
В настоящее время некодирующие РНК классифицируются по их основным функциям
• структурные РНК
• регуляторные РНК.
Структурные нскодирующие РНК, включают в себя транспортные РНК (tRNA), рибосомальные РНК (rRNA), сплайсеосомные РНК (snRNA), малые нуклеолярные РНК (snoRNA). Большинство из этих типов некодирующих РНК имеют ярко выраженную структурную функцию. (Mattick and Makunin., 2006):
Некодирующие РНК с регуляторной ролью в генной экспрессии классифицируются, как регуляторные некодирующие РНК и по размеру подразделяются на малые и длинные некодирующие РНК
К основным типам малых некодирующих РНК относят:
• малые интерферирующие PIlK(siRNAs).
• микроРНК (miRNAs)
• РНК, взаимодействующие с Piwi (piRNAs)