Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников Камчатки

• Автор: Гумеров, Вадим Мирбаевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Систематика термофильных прокариот
2. Методы геномного секвенирования
3. Методы анализа микробных сообществ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Микробное сообщество воды источника Заварзина
2. Микробное сообщество источника «1884»
3. Микробные сообщества кислых термальных источников «1805» и «1810»
4. Оценка биоразнообразия микробных сообществ
5. Секвенирование и анализ генома термоацидофильной археи Vulcanisaeta moutnovskia
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Исследование структуры микробных сообществ, ассоциированных с высокотемпературными экологическими нишами, представляет интерес для фундаментальной микробиологии, в том числе эволюционной, поскольку многие обитающие в этих условиях микроорганизмы относятся к эволюционно древним ветвям бактерий и архей. Анализ структуры сообществ термофильных микроорганизмов проводился с момента их обнаружения около 40 лет назад микробиологическими методами, предполагающими получение и характеристику чистых культур микроорганизмов. В последние 20 лет также применяются не требующие культивирования микроорганизмов молекулярные методы, основанные на ПЦР-амплификации фрагментов генов 16S рРНК из природного образца, их клонировании и секвенировании независимых клонов. Сравнение полученных последовательностей с известными генами 16S РНК позволит определить, микроорганизмы каких групп присутствуют в сообществе и в каких соотношениях. Применение методов анализа 16S рРНК показало, что, как правило, не более 0.1-1% микроорганизмов удается культивировать в лабораторных условиях. Эти работы позволили выявить новые филогенетические группы прокариот, в том числе таксоны высокого уровня, для многих из которых до настоящего времени не получено культивируемых представителей. Однако, применявшиеся до последнего времени методы анализа 16S РНК предполагали клонирование фрагментов генов 16S РНК и независимое ссквенирование отдельных клонов с помощью капиллярного электрофореза, что на практике позволяло проанализировать не более нескольких сот последовательностей 16S рРНК. В то же время, многие природные сообщества могут содержать тысячи различных видов микроорганизмов (Huber et al., 2007).
Развитие методов геномного секвенирования в последние несколько лет позволило совершить качественный скачок в их производительности, заключающийся в возможности проведения единовременного анализа не десятков-сотен, а нескольких сот тысяч нуклеотидных последовательностей. Применение методов пиросеквенирования позволяет проводить «глубокую» характеристику микробного сообщества, выявляя не только доминирующие микроорганизмы, но и минорные компоненты сообщества, которые, однако, могут играть важную экологическую роль (Sogin et al. 2006; Roesch et al. 2007; Krause et al. 2008). Появляется возможность достоверного количественного определения долей отдельных групп микроорганизмов,

что необходимо для реконструкции путей метаболизма сообщества в целом. Микробные сообщества термальных местообитаний, в силу большого фундаментального и прикладного интереса к ним, стали одними из первых объектов молекулярного анализа биоразнообразия, основанного на высокопроизводительном анализе 16S рРНК методами пироссквенирования (Miller et al., 2009). Однако, до настоящего времени опубликовано лишь несколько работ по изучению сообществ термофильных микроорганизмов Йеллоустонского парка (США) и Исландии с использованием пиросеквенирования.
В Российской Федерации исследования термофильных микроорганизмов были начаты в конце 1970-х годов в Институте микробиологии РАН. В значительной степени их успеху способствовало наличие в нашей стране уникального природного объекта, -многочисленных и разнообразных по своим физико-химическим характеристикам термальных источников Камчатского вулканического района, в первую очередь Долины гейзеров и кальдеры вулкана Узон.
За последние 30 лет из термальных источников Камчатки было выделено большое число новых термофильных бактерий и архей, в том числе представляющих обособленные филогенетические группы и характеризующихся различными типами метаболизма (Заварзин и др., 1989; Заварзин, 2004; Лебединский и др., 2007). Однако по сравнению с Йсллоустонским парком и Исландией, биоразнообразие термофильных микроорганизмов Камчатки изучено значительно менее глубоко. Помимо культуральных методов, для характеристики термофилов Камчатки использовались традиционные молекулярные методы анализа 16S рРНК, однако, число анализируемых независимых последовательностей в разных работах не превышало нескольких десятков.
Таким образом, задача «глубокой» количественной характеристики сообществ термофильных микроорганизмов, в особенности горячих источников Камчатки, является актуальной и представляет интерес для фундаментальных исследований в области микробиологии и молекулярной биологии. Данная задача имеет и практическое значение, обусловленное биотехнологическим потенциалом термофильных микроорганизмов в качестве источника новых ферментов.
Предметом настоящей работы является молекулярный анализ микробных сообществ нескольких термальных источников кальдеры вулкана Узон с различными физико-химическими характеристиками.

образце. Это означает, что с увеличением разнообразия микробного сообщества скорость реассоциации ДНК уменьшается (Thcron and Clocte, 2000). К недостаткам метода относятся снижение скорости ДНК-реассоциации из-за присутствия примесей в образце ДНК и зависимость результатов анализа от использованных методов выделения и очистки ДНК (Theron and Cloete, 2000).
Еще одним методом выявления подобия сообществ является гибридизация. Метод основан на специфическом связывании зондов с комплементарной целевой ДНК или РНК (Theron and Cloete, 2000). В качестве зондов используют олиго- или полинуклеотидные цепи, сконструированные на основе известных нуклеотидных последовательностей, меченые на 5’-конце маркерами. Такими маркерами могут служить радиоактивные изотопы либо (все чаще в последнее время) флуоресцентные маркеры, содержащие производные флуоресцеина или родамина (Kirk et al., 2004). В качестве зонда может быть использован и целый геном. Например, при определении наличия одинаковых организмов независимо от их видовой принадлежности, проводится реципрокная гибридизация между выделенной и очищенной ДНК одного образца и другого (Theron and Cloete, 2000). Меченная тотальная ДНК, выделенная из какого-то одного образца, используется в качестве контроля. Неопределенность относительного содержания микроорганизмов в популяции, кинетика гибридизации, а также возможные различия в эффективности мечения ДНК в значительной степени осложняют интерпретацию результатов (Theron and Cloete, 2000). Данный метод малопригоден для детекции различий между сообществами с относительно высокой степенью сходства последовательностей ДНК (Ranjard et al., 2000).
Оценку относительного содержания различных групп микроорганизмов можно проводить с помощью количественной “dot-blot” гибридизаци.
Методы гибридизации могут быть использованы как на выделенной ДНК и РНК, так и па клеточном уровне in situ (Kirk et al., 2004). При гибридизации in situ не требуется выделение нуклеиновых кислот, что существенно сокращает трудоемкость, время проведения и стоимость такого анализа. С помощью данного метода можно определять не только морфологию и численность клеток культивируемых культур, но и их пространственное распределение. Однако метод не лишен и недостатков; в частности, одним из ограничений метода in situ гибридизации является не очень высокая чувствительность: вероятность обнаружения микроорганизмов,
присутствующих в небольшом количестве, низка (Kirk et al., 2004).