Роль пространственной организации геномного локуса в феномене переключения экспрессии глобиновых генов

• Автор: Ульянов, Сергей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ - 9

1.1. ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА - 9

1.1.1. Хроматиновые домены

1.1.2. Инсуляторы

1.1.3. Регуляция транскрипции зонами контроля локуса. Хроматиновый хаб

1.2 ДОМЕН АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР

1.2.1. Общая характеристика и структурно-функциональные элементы домена

1.2.2. Регуляция транскрипции внутри домена

1.3. ДОМЕН БЕТА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР
1.3.1. Общая характеристика
1.3.2. Пограничные элементы домена
1.3.3. Регуляция транскрипции внутри домена
1.4. ФЕНОМЕН ПЕРЕКЛЮЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ,
1.5. МЕТОД ФИКСАЦИИ КОНФОРМАЦИИ ХРОМОСОМЫ (ЗС)
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
П. 1. Выделение эмбриональных эритроцитов и фибробластов
11.2. Работа с ДНК - 48
11.3. Работа с РНК - 49
11.4. ПЦР в реальном времени с ТацМап-пробами - 51
11.5. ЗС-анализ
11.6. Программное обеспечение - 53
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
III. 1. Измерение уровня транскрипции глобиновых генов - 59
111.2. Проверка использованной последовательности домена бета-глобиновых генов на наличие несеквенированного участка в пределах ВНБ4 - 61
111.3. ЗС-анализ - 62
111.4. Анализ пространственной конфигурации домена альфа-глобиновых генов кур в эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов - 69

III.5. Анализ пространственной конфигурации домена бета-глобиновых генов в эритроидных клетках и фибробластах куриных эмбрионов
IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
IV. 1. Альфа-глобиновый хроматиновый хаб в эритроидных клетках 3-дневных
куриных эмбрионов - 82
IV.2. Бета-глобиновый хроматиновый хаб в эритроидных клетках 3-дневных
куриных эмбрионов. Две альтернативных конформации - 85
IV.3. Бета-глобиновый хроматиновый хаб в эритроидных клетках на 9-м дне развития куриного эмбриона
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
п.н. пары нуклеотидов
ПЦР полимеразная цепная реакция
т.п.н. тысячи пар нуклеотидов (ДНК)
ВАС искусственная бактериальная хромосома (bacterial artificial chromo-
some)
ЗС фиксация конформации хромосомы (chromosome conformation cap-
ture)
Ct пороговый цикл (threshold cycle)
CEF куриные эмбриональные фибробласты (chicken embryonic fibroblasts)
CTCF СССТС-связывающий транскрипционный фактор (CCCTC-binding
transcription factor
DHS (HS) участок гиперчувствительности к ДНКазе I (DNasel hypersensitive site)
DMEM среда Игла, модифицированная Дульбекко (Dulbecco’s modified
Eagle’s medium)
DTT дитиотреитол (dithiothreitol)
dNTP дезоксирибонуклеотидтрифосфат (desoxyribonucleotide triphosphate)
EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота, ЭДТА (ethylendiaminetethraace-
tate)
GTF общие факторы транскрипции (general transcription factors)
HAT гистонацетилтрасфераза (histoneacetyltransferase)
HDAC гистондеацетилаза (histoncdeacetylase)
Kbp тысячи пар нуклеотидов (kilobase pairs)
LCR область контроля локуса (locus control region)
MAR участок, ассоциированный с матриксом (matrix associated region)
MRE главный регуляторный элемент (major regulatory element) домена аль-
фа-глобиновых генов кур PBS фосфатно-солевой буфер (phosphate-buffered saline)
RT-PCR ПЦР в реальном времени (real-time polymerase chain reaction)
SDS додецилсульфат натрия (sodium dodecylsulfate)
ТАЕ трис-ацетатный-ЭДТА (tris-acetate-EDTA) буфер для электрофореза
TSS точка старта транскрипции (transcription start site)
удаётся наблюдать исчезновение всех DHS в пределах домена (Villenponteau and Martison, 1987; Sjakste, 2002).
В общем случае активация транскрипции внутри геномного домена происходит в две стадии: активация самого домена как целого и последующая активация конкретных промоторов. Активация домена бета-глобиновых генов в эритроидных клетках начинается с массированного ацетилирования гистонов на протяжении всего домена и перевода хроматина в открытую конфигурацию, после чего транскрипционные факторы получают доступ к промоторам генов и главным регуляторным элементам домена: p/е-энхансеру и зоне контроля локуса (DHS1-3) (Chapman and Tobin, 1979; Abruzzo and Reitman, 1994).
В ранних исследованиях регуляторной системы бета-глобинового кластера кур (Reitman, Lee et al., 1990) было обнаружено, что в трансгенных мышах, несущих фрагмент куриного генома, содержащий ген рА и p/е-энхансер, наблюдается подавление эффекта положения - то есть, уровень экспрессии гена рд не зависит от места интеграции в геном и находится в прямой зависимости от числа копий трансгена. Позднее было выяснено, что свойством «открывать» хроматин обладает не сам энхансер, а его комплекс с промотором pA (Reitman, Felsenfeld et al., 1993). Свойство защиты трансгена от эффекта положения было известно у открытых к тому времени зон контроля локуса в доменах бета-глобиновых генов мыши и человека (Grosveld et al., 1987). По аналогии с этими LCR был сделан вывод, что зона контроля локуса домена бета-глобиновых генов кур расположена в районе гена рА и p/е-энхансера (Reitman et al., 1993). Этот вывод впоследствии был опровергнут исследованиями роли DHS1-3 в регуляции транскрипции бета-глобиновых генов (Reitman et al., 1995; Mason et al., 1995).
DHS 1-3 не имеют структурной гомологии с бета-глобиновыми DHS млекопитающих (Reitman et al., 1993), и содержат сайты связывания как для конститутивных, так и для эритроидспецифичных транскрипционных факторов. В опытах по транзиентной трансфекции с использованием куриных эритроидных предшественников было показано, что заметной энхансерной активностью обладают лишь DHS2 и DHS3. В пределах DHS2 расположены 4 сайта связывания эритроидспецифичного транскрипционного фактора GATA-1, 2 сайта связывания Spl-подобного фактора и один сайт для EKLF, причём внесение точечных мутаций практически не влияет на энхансерную активность, если не затронуты сайты связывания GATA-1 (Abruzzo and Reitman, 1994). В опытах по трансгенезу была показана способность DHS1-3 супрессировать эффект положения, причём трансгены, содержащие только один DHS из трёх, не были защищены от эффекта положения при интеграции в геном, независимо от того, обладал ли данный DHS энхансерной активностью в опытах по транзиентной трансфекции (Abruzzo and Reitman, 1994). В опытах с