Разработка методов направленной модификации бактериальной хромосомы для метаболической инженерии облигатного метилотрофа Methylophilus methylotrophus AS1

• Автор: Токмакова, Ирина Львовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий

ТЕЕ Общая характеристика метилотрофных бактерий

ЕЕ2. Ростовые характеристики и основные продукты, получаемые с использованием метилотрофных бактерий

ЕЕЗ. Экономический аспект применения метилотрофных организмов в биотехнологии

1.1.4. Генетические методы, используемые для метаболической инженерии метилотрофных бактерий
1.2. Бактериофаг Ми: вирус и транспозон
1.2.1. Последовательности ДНК, необходимые для Ми-транспозиции
1.2.2. Белки, принимающие участие в репликативной транспозиции бактериофагами
1.2.3. Этапы транспозиции фага Ми
1.2.4. Бактериофаг Ми как инструмент для генной иженерии. 48 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования
2.2 Олигонуклеотиды
2.3. Стандартные генно-инженерные методики
2.4. Межродовая конъюгация
2.5. Электротрансформация клеток М. теШу1о1горкш
2.6. Интеграция гшш-Ми транспозона в хромосому М. теМуШгоркш
2.7. Удаление маркера [РКГ-КтК-/7’А’7] из хромосомы
2.8. Тестирование синтеза амилазы и С230 в клетках метилотрофов
2.9. Амплификация гшш-Ми транспозона в хромосоме метилотрофов.
2.10. Конструирование рекомбинантных плазмид.
2.10.1. Конструирование интегративных плазмид на основе рМГУ5-[ГЛГ-Кта-Е7?7]-МоЬ.
2.10.2. Конструирование интегративных плазмид на основе плазмиды рАН162.
2.10.3. Конструирование плазмид рАУСТЕК-агаРнсо и рАУСТЕК-ЬгаЕсо-
2.10.4. Клонирование генов ароматического пути биосинтезам теЖуЬоркия АБ1.
2.10.5. Конструирование плазмид и линейных фрагментов для мутагенеза. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Адаптация системы транспозиции бактериофага Ми для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому М. тевгукУгоркш АБ1.
3.1.1. Конструирование хелперных плазмид с термоиндуцибельными генами факторов Ми-зависимой танспозиции.
3.1.2. Конструирование интегративных векторных плазмид, способных к мобилизационному переносу в М. теЖуЫгоркш.
3.1.3. Ми-зависимая транспозиция маркера устойчивости к канамицину в геном М. тевгуШгоркш.
3.1.4. ЕЬР-/7/?Г-зависимое удаление интегрированного Кт1!-маркера из хромосомы метилотрофов.
3.1.5. Последовательная Ми-зависимая транспозиция нескольких генов в М тевгу1о!горки.ч.
3.1.6. Амплификация гшш-Ми в хромосоме М. теЖуШгоркиз.
3.1.7. Исследование влияния энхансерной последовательности бактериофага Ми на амплификацию интегрированных фрагментов ДНК в бактериальном геноме.
3.1.8. Использование гена ZsGreen 2оап11гш эр. в качестве селективного маркера для амплификации гшш-Ми в хромосоме М. те1/гу1о(горкш
3.2. Создание коллекции ауксотрофных мутантов с нарушенным

биосинтезом ароматических аминокислот у МеікуІорШІш теЛуШгоркш АБ1 умгоРесо
3.2.1. Влияние амплификации генов агоР и Ьт()Е. соїі на чувствительность М. теЖуШгоркш АБ1 к аналогам ароматических аминокислот и валину
3.2.2. Клонирование генов 1грЕОБМтс через функциональную комплементацию їгрЕ мутанта Е. соїі и инактивация іїрЕ в хромосоме М. МеЖуШгорИш А81
3.2.3. Клонирование и инактивация генов М. meth.ylotroph.us АБІ, вовлеченных в пути биосинтеза ароматических соединений, оптимизация экспериментальной процедуры
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Адсорбция фага и инъекция фаговой ДНК в клетку
Индукция литического цикла: Репликативная транспозиция
Лизогенные клетки, содержащие профаг
Клеточное деление
Рис. 1.2. Жизненный цикл бактериофага Ми. Во время инфекции фаг адсорбируется на клетке-хозяине и впрыскивает свою линейную двухцепочечную ДНК в клетку. Вместе с ней в клетку попадает также кодируемый фагом белок N, который, связываясь с гетерогенными фрагментами ДНК предыдущего хозяина, присутствующими на концах Ми, циклизует фаговый геном (liarshey R. М. and Bukhari A. /., 1983) (на рисунке не показано). Затем ДНК фага встраивается в случайное место хромосомы клетки-хозяина по механизму консервативной транспозиции (Akroyd J. Е. and Symonds N., 1983; Chaconas G. et al., 1983; Harshey R. M, 1984). Инфекция и последующая интеграция могут привести (с низкой частотой) к лизогенизации клетки или (с высокой частотой) к литическому циклу (Howe М. М. and Bade, 1975) В лизогенном состоянии вирусный геном остается интегрированным в хромосому, как профаг, и его литические функции находятся в репрессированном состоянии в течение нескольких последовательных циклов деления клетки. Во время литического цикла транспозаза (вместе с другими факторами транспозиции) катализирует несколько раундов репликативной транспозиции, в которых большое число новых копий первоначально интегрированного фагового генома встраиваются в новые места бактериальной хромосомы (Chaconas G. et al., 1981). К литическому пути развития бактериофаг может переходить и из лизогенного состояния в результате индукции (Howe М. М. and Bade, 1975). Вследствие репликации фаговой ДНК в процессе транспозиции и экспрессии специфичных белков фага хромосома клетки-хозяина разрушается, и фаговая ДНК упаковывается в вирусные частицы. Каждая вновь образованная частица вируса содержит линейную двухцепочечную молекулу ДНК фага